張燕青

（天津科技大學生物工程學院，天津 300000）

1 木聚糖酶的特性

1.1 誘導性

木聚糖酶主要是誘導酶。木聚糖酶的生產(chǎn)除了和菌株本身的特點息息相關(guān)，還與培養(yǎng)基中的誘導物密切相關(guān)。向基質(zhì)中加入誘導物可以產(chǎn)生誘導效應或阻遏作用，并且一種物質(zhì)對于某一微生物生產(chǎn)木聚糖酶具有誘導活性，但對于另外一微生物可能是抑制劑。研究表明，木聚糖自身是絕大部分木聚糖酶菌株的有效誘導劑。此外，某些小分子物質(zhì)如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖等對不同菌株產(chǎn)酶的影響不同，例如葡萄糖、木糖對于一些菌株的產(chǎn)酶過程是誘導劑，而對于另一些菌株卻有明顯的阻遏作用。

1.2 耐熱性

來源不同的木聚糖酶的組成和性質(zhì)差別很大。例如來源于細菌和放線菌的木聚糖酶最適溫度在50～60℃，真菌木聚糖酶的最適溫度約為50℃，其耐熱性比細菌來源的木聚糖酶差，嗜熱微生物能產(chǎn)生耐高溫木聚糖酶，更有利于某些工業(yè)化生產(chǎn)過程。比如制漿過程是用高溫蒸煮方法除去木屑中的木質(zhì)素。因此，用于紙漿漂白的木聚糖酶應該是耐熱的。

1.3 耐酸堿性

來源不同的木聚糖酶最適pH和pH的穩(wěn)定范圍也各不相同。一般來說，來源于真菌的木聚糖酶為酸性木聚糖酶，最適pH為4.0～6.0；細菌和放線菌的木聚糖酶為中性或堿性木聚糖酶，pH穩(wěn)定性較真菌高，穩(wěn)定在6.0～8.0，而極端微生物則能產(chǎn)生適宜于特殊環(huán)境的木聚糖酶?，F(xiàn)已有一些嗜酸性和耐堿性細菌的木聚糖酶基因通過載體構(gòu)建以及受體菌的選擇獲得高效表達。

2 人工改良酶分子的方法

鑒于其高效專一的催化特性，生物酶制劑已成功應用于醫(yī)藥、化工、食品、新能源開發(fā)及環(huán)保等領(lǐng)域，然而某些生產(chǎn)過程工藝環(huán)節(jié)復雜，對酶特性有嚴格要求，甚至需要高鹽、高溫、強堿、強酸、有毒介質(zhì)、非水相等特殊反應體系，而自然界中的天然酶對外界條件較敏感極易失活。

為了獲得酶學特性優(yōu)良的酶制劑，研究不斷改進人工改良酶分子的方法。由于改進常規(guī)的誘變育種方法難以在短期內(nèi)達到預期目標，操作過程危險，因此逐漸被基因工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)取代。目前，人工改良酶蛋白質(zhì)分子主要通過理性設(shè)計、非理性設(shè)計及介于兩者之間的半理性設(shè)計來實現(xiàn)。

2.1 理性設(shè)計

根據(jù)已有信息通過改變或修飾酶分子中的個別氨基酸殘基，而產(chǎn)生具有預期新功能的酶分子突變體的方法，即為理性設(shè)計。然而理性設(shè)計需要對所研究的蛋白酶分子進行較全面了解，只有在掌握大量信息的前提下才能做出具有實用性改造方案。經(jīng)過大量的積累蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能等相關(guān)方面的信息才能有目標的選取突變位點并對其作出改造。理性設(shè)計不僅需要對酶分子的三維結(jié)構(gòu)進行透徹的解析，而且還需要熟悉酶分子的一級結(jié)構(gòu)與立體結(jié)構(gòu)間復雜的對應關(guān)系，并作出合理判斷。此外，經(jīng)修飾導致的特定區(qū)域內(nèi)某氨基酸殘基改變而導致的蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變往往不能通過計算機輔助預測。但是隨著研究的進一步發(fā)展，理性設(shè)計在分析和分子模擬對接的基礎(chǔ)上，找出酶結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵位點進行相應改造，目標更為明確，操作相對簡單，理性設(shè)計必將成為酶改造的主流方案。

2.2 非理性設(shè)計

通過隨機突變、基因重組等方法得到突變體庫，然后采用定向篩選方法得到所需酶分子的方法，即為非理性設(shè)計。非理性設(shè)計無需了解酶蛋白分子準確結(jié)構(gòu)及其他方面的相關(guān)信息。但此方法突變較為隨機、試驗周期長、工作量較大、篩選獲得目的菌株幾率低。

2.2.1 提高酶分子應用性能的改造方法

酶的體外定向進化即為分子進化，人為模擬隨機突變、重組和自然選擇等自然進化機制，創(chuàng)造體外特殊條件，隨機誘變酶基因，用高效簡潔的篩選方法定向選出所需的突變酶。如易錯PCR、DNA改組、串聯(lián)重復插入（TRINS）、體外隨機引發(fā)重組（PRP）、臨時模板隨機嵌合生長（RACHITT）等。

易錯PCR和連續(xù)易錯PCR是改變普通PCR的反應條件（調(diào)整4種dNTP的比例、添加Mn2+、上調(diào)Mg2+濃度、使用較低保真度的Taq酶等）將堿基隨機錯配率相對提高，在原來序列上引入多點突變，構(gòu)建質(zhì)量高、容量大的突變庫，利用簡便的方法篩選出優(yōu)質(zhì)的目的突變體，此方法即為易錯PCR。介于該方法只在單一分子內(nèi)部發(fā)生遺產(chǎn)改變，因此稱其為無性進化[1]。其耗時費力，故只用來對較小基因片段（＜800 bp）進行改造。通常經(jīng)一輪的易錯PCR很難篩選到滿意的突變株，故需連續(xù)多輪易錯PCR，該方法是將上一次易錯PCR的有益突變基因片段作為下一次易錯PCR的模板，依次循環(huán)連續(xù)地進行隨機誘變，疊加每一次的有益突變而獲得大幅度突變的結(jié)果。

DNA改組和基因家族改組是一種在體外進行的同源重組技術(shù)。對來源不同但功能相近的同源基因群進行改造，從而獲得優(yōu)勢突變組合的蛋白質(zhì)。基本操作流程：選定基因，經(jīng)過隨機突變生成帶有不同突變的基因群，用DNaseⅠ隨機切割，所得到的片段之間互為模板和引物進行多輪不添加引物的PCR，直至獲得全長基因，最后加入依據(jù)完整基因兩端序列設(shè)計的引物進行常規(guī)PCR，獲得改組后的基因庫。此方法能快速積累有益突變，具有理論和實際應用價值。基因家族改組利用DNA改組技術(shù)對在自然界進化上相關(guān)的一系列基因或基因家族進行同源改組。

串聯(lián)重復插入（TRINS）是通過滾環(huán)復制的方式將原始基因以兩個或多個序列串聯(lián)的形式插入到目的基因中。TRINS模擬自然進化過程中的復制插入機制，當沒有合適的高通量篩選時，TRINS的優(yōu)勢就顯現(xiàn)出來。

交錯延伸重組（STEP）將帶有不同點突變的模板進行混合，合并普通PCR的退火和延伸兩步為一步，進而縮短反應時間，合成非常短的新生鏈，此后再以這些新生鏈作為引物隨機地雜交到含不同突變的模板上，繼續(xù)PCR，反復進行該過程，結(jié)果會得到含有模板上間隔序列的新生的全長基因。從而得到新性質(zhì)的酶。

臨時模板隨機嵌合生長（RACHITT）是把隨機切割的基因短片段雜交到一個臨時DNA模板上，排序后進行修剪重復、填補空隙和連接的方法。其中臨時模板是一條間隔一定序列插入尿嘧啶的單鏈DNA，懸垂切割獲得更短的片段，然后進行重組。

2.2.2 提高酶蛋白異源表達產(chǎn)量的分子改造方法

工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶蛋白產(chǎn)品，通常希望能盡可能的提高產(chǎn)品的表達量，從而降低生產(chǎn)和使用成本?；蚬こ痰难该桶l(fā)展已使得很多蛋白質(zhì)產(chǎn)品實現(xiàn)了工程菌株的異源表達，由于影響蛋白質(zhì)異源表達的因素較多，微生物酶分子設(shè)計時需關(guān)注的一個重要方面就是要消除影響外源基因表達的諸多不利因素，從而提高表達量?？刹扇〉牟呗杂校好艽a子優(yōu)化、調(diào)整GC含量等手段，改造信號肽，截斷表達，融合表達等手段。

改造信號肽。需要被運輸?shù)教囟ㄎ恢玫亩嚯亩己幸欢畏Q之為信號肽的氨基酸序列，其將多肽引導至對應的位置。外源蛋白分泌至胞外，一方面消除對宿主細胞的正常生長代謝影響，另一方面避免宿主對目的蛋白的降解，此外還可以提高純化效率。因此通過目的基因自身的信號肽或表達載體的信號肽實現(xiàn)分泌表達來提高外源基因的產(chǎn)量是比較可取的生產(chǎn)方式。合適的信號肽甚至可使分泌到胞外的目的蛋白含量＞分泌到胞外總蛋白的90%。對于某些難分泌的蛋白，則可嘗試采用其他的信號肽，或者對原有信號肽進行改造[2]。

密碼子優(yōu)化和GC含量調(diào)整。不同物種由于表達系統(tǒng)缺乏識別某些密碼子的tRNA而具有密碼子偏愛性。如果外源基因中含有較多的宿主菌非偏愛型密碼子，就會嚴重影響其在宿主菌中的表達。由于密碼子的兼并性，故可在不改變外源基因氨基酸序列的前提下，優(yōu)化外源基因，而提高外源蛋白的表達量。Mechold等將生物素酶BirA密碼子進行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)其表達量提高5倍[3]。然而Wu等優(yōu)化密碼子后，在大腸桿菌中表達組蛋白和谷氧還蛋白發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量并未有所提高[4]。四種脫氧核苷酸基因序列中的排布以及含量和比例可以影響目的蛋白在宿主中的表達量。Burland等發(fā)現(xiàn)，有些基因在畢赤酵母的表達系統(tǒng)中會導致轉(zhuǎn)錄的提前終止[5]。故為了保證表達效果需要進行GC含量調(diào)整，又要兼顧密碼子偏好性。

截斷表達。對于酶蛋白分子，其編碼基因序列的有些區(qū)域并非酶活性所必須的特定的或隨機截斷某些基因片段，通過此種改造方法可改善酶學性質(zhì)滿足生產(chǎn)需要。其中截斷位點可以是單一的，也有進行多位點截留的。通過隨機截斷從而構(gòu)建出截斷庫，然后篩選得到目的突變酶。Hai等通過對來源于NE1的藻青素合成酶的截短研究表明，截去C端45個氨基酸后該酶仍然保留全酶的活性，繼續(xù)向上截去一個氨基酸Glu865，則酶活全部喪失；由此得出Glu865是該酶活性中心的一個關(guān)鍵氨基酸，同時截斷表達還可以協(xié)助研究酶特定氨基酸殘基的功能[6]。

融合表達。雙功能酶是一條多肽鏈，能同時催化兩個不同的生化反應。由于反應發(fā)生在同一條肽鏈上，雙功能酶通常催化效率比較高。雙功能酶的出現(xiàn)對生命體的生存有著重要意義。目前普遍認為是在自然進化的選擇壓力下，編碼功能相關(guān)蛋白的基因之間的融合而形成的[7]。這樣功能相關(guān)的基因同位于一條肽鏈上即可享用同一套調(diào)控元件，能高效方便地調(diào)控蛋白質(zhì)表達，還能拉進空間位置進而增強蛋白質(zhì)間的互作。雙功能酶通常由兩個或多個結(jié)構(gòu)域組成。研究表明從一株熱纖維梭菌中分離得到一個由GH10家族木聚糖酶和酯酶組成的雙結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)[8]。

2.3 半理性設(shè)計

在酶分子基因序列比對分析的基礎(chǔ)上，找出潛在的關(guān)鍵氨基酸殘基位點進行定點突變，通過驗證得到目標酶突變體，即為半理性設(shè)計。該方法相對非理性設(shè)計中的定向進化目標更明確、成功率也提高了，而且不需了解酶晶體結(jié)構(gòu)，還避免了大量篩選工作，半理性設(shè)計改造策略成為酶分子改造的一種更合適的選擇。

3 展望

前期的大量研究使得人們對木聚糖酶分子結(jié)構(gòu)和酶學性質(zhì)的相關(guān)性有了一定程度的了解，通過分子改造等生物技術(shù)得到了一些適合工業(yè)生產(chǎn)的改良蛋白酶，但還尚未形成系統(tǒng)的、具有指導性的、普遍適用的方法論。隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程等高新技術(shù)的深入發(fā)展，科學的方法論體系必將在大量科研實踐的基礎(chǔ)上建成，從而創(chuàng)造出各行各業(yè)需要的性質(zhì)優(yōu)良的酶制劑。

[1]Wang Y,Yuan H,Wang J,et al.Truncation of the cellulose bind?ing domain improved thermal stability of endo-beta-1,4-gluca?nase from Bacillus subtilis JA18[J].Bioresource Technology,2009,100（1）:345-349.

[2]Xiong A S,Yao Q H,Peng R H,et al.High level expression of asynthetic gene encoding Peniop horalyciiphytasein methylotro?phic yeast Pichiapastoris[J].Applied Microbiology&Biotechnolo?gy,2006,72（5）:1 039-1 047.

[3]Mechold U,Gilbert C,Ogryzko V,et al.Codon optimization of the BirA enzyme gene leads to higher expression and an improved effi?ciency of biotinylation of target proteins in mammalian cells[J].Journal of Biotechnology,2005,116（3）:245-259.

[4]Wu X,Jornvall H,Berndt K D,et al.Codon optimization reveals critical factors for high level expression of two rare codon genes in Escherichia coli:RNA stability and secondary structure but not tRNA abundance[J].Biochemicaland Biophysical Research Com?munications,2004,313（1）:89-96.

[5]Burland T G.DNASTAR's Lasergene sequence analysis software.[J].Methods in Molecular Biology,2000,132:71-91.

[6]Hai T,Lee J S,Kim T J,et al.The role of the C-terminal region of cyanophycinsynthetase from Nostocellipsosporum NE1 in its enzy?matic activity and thermostability:a key function of Glu(856)[J].Biochimica et BiophysicaActa(BBA)-Proteins and Proteomics,2009,1 794（1）:42-49.

[7]Joucla G,Pizzut S,Monsan P,et al.Construction of a fully active truncated alternansucrase partially deleted of its carboxy-termi?nal domain[J].FEBS Letters,2006,580（3）:763-768.

[8]Davids T,Schmidt M,Bottcher D,et al.Strategies for the discov?eryand engineering of enzymes for biocatalysis[J].Current Opin?ion in Chemical Biology,2013,17（2）:215-220.