高迪，陳淵錦，劉羽丹，張囡，沙磊

(中國醫(yī)科大學藥學院，沈陽 110122)

瑞替加濱對離體大鼠十二指腸平滑肌收縮功能的影響及其機制

高迪，陳淵錦，劉羽丹，張囡，沙磊

(中國醫(yī)科大學藥學院，沈陽 110122)

目的 探討瑞替加濱對離體大鼠十二指腸平滑肌收縮功能的影響及其機制。方法 取大鼠十二指腸腸管剪成長度約1.5 cm的腸段，采用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)持續(xù)記錄張力曲線。十二指腸腸管張力曲線穩(wěn)定后行以下試驗：①依次予3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L的瑞替加濱溶液干預，每個濃度作用時間均為15 min，中間用Kreb′s溶液沖洗20 min。測量瑞替加濱干預前及各濃度干預后十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅。②加入10 μmol/L XE-991作用15 min，再加入20 μmol/L瑞替加濱作用15 min。計算瑞替加濱加藥前后離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率。③加入20 μmol/L瑞替加濱作用15 min，再加入10 μmol/L XE-991作用15 min。比較XE-991加藥前后離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率。結果 ①瑞替加濱作用下離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅(基線值)變化百分率為100%。各濃度瑞替加濱作用下張力曲線的平均振幅變化百分率均低于基線值，P均<0.05。在6.25～200 μmol/L范圍內，隨著瑞替加濱濃度增加提高，平均振幅變化百分率逐漸下降，P均<0.05。②瑞替加濱加藥前后XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率無統(tǒng)計學差異，P>0.05。③XE-991加藥后瑞替濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅高于加藥前，P<0.05。結論 瑞替加濱在6.25～200 μmol/L范圍內可呈劑量依賴性抑制大鼠離體十二指腸平滑肌收縮；其機制可能為激活鉀離子通道。

瑞替加濱；十二指腸；平滑?。皇湛s功能；鉀離子通道；體外實驗

瑞替加濱是一種治療成人局限性癲癇發(fā)作的新藥[1]，主要通過激活電壓依賴性鉀通道(主要為Kv7.2-7.5通道)發(fā)揮作用[2]。瑞替加濱的主要不良反應包括尿潴留、神經精神癥狀、停藥反應、心律失常以及胃腸道不良反應，其中胃腸道不良反應主要有惡心、便秘、消化不良[3，4]。提示在胃腸系統(tǒng)可能存在對瑞替加濱敏感的鉀離子通道，瑞替加濱可能通過這些鉀離子通道影響胃腸道平滑肌收縮，但查閱文獻未見相關報道。2016年10～12月，我們觀察了不同濃度瑞替加濱對離體大鼠十二指腸平滑肌收縮功能的影響，以及用鉀離子通道阻滯劑XE-991阻斷鉀離子通道后離體大鼠十二指腸平滑肌收縮功能的變化?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級成年健康SD大鼠16只，體質量80～220 g，雌雄不限，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。瑞替加濱(純度≥98%)購于上海源葉生物有限公司。鉀離子通道阻滯劑XE-991(純度>98%)購于美國Santa Cruz公司。葡萄糖為分析純，購于天津光復精細化工研究所。胃腸動力測量系統(tǒng)由JZ100型張力換能器和BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)組成。

1.2 離體十二指腸腸管的制備及實驗系統(tǒng)連接 大鼠實驗前1 天禁食8 h，不禁水。將大鼠放入CO2麻醉箱中麻醉后處死，立即剖開腹腔，取十二指腸，將腸管剪成長度約1.5 cm的腸段，清除腸系膜及腸道內容物后，將腸管置于充滿Kreb′s溶液的恒溫槽中，兩端分別固定于恒溫槽中的固定鉤和張力換能器上，張力換能器連接BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，由BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)持續(xù)記錄張力曲線。Kreb′s溶液溫度(36±1)℃，并持續(xù)通入含有97%O2、3%CO2混合氣。Kreb′s溶液為使用前現(xiàn)配。配制方法為：稱取7.02 g NaCl、 0.44 g KCl、0.19 g NaH2PO4·2H2O、1.302 g NaHCO3、2.07 g 葡萄糖溶于800 mL雙蒸水中得到溶液1，稱取0.244 g MgCl26H2O、0.278 g CaCl2溶于200 mL雙蒸水中得到溶液2，將溶液1、2混合均勻即得到Kreb′s溶液。

1.3 不同濃度瑞替加濱對離體十二指腸腸管平滑肌收縮功能影響的觀察 待十二指腸腸管張力曲線穩(wěn)定后，先記錄張力曲線15 min，然后在恒溫槽中依次加入 3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L的瑞替加濱，每個濃度作用時間均為15 min，中間用Kreb′s溶液沖洗20 min。測量瑞替加濱濃度為0(給藥前)、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L時離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅。各濃度瑞替加濱作用下十二指腸腸管張力曲線平均振幅變化百分率=各濃度瑞替加濱作用下十二指腸腸管張力曲線平均振幅/平均振幅基線值×100%。實驗重復6次，取均值。

1.4 瑞替加濱對XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌收縮功能影響的觀察 另取一套實驗系統(tǒng)，待十二指腸腸管張力曲線穩(wěn)定后，加入10 μmol/L的XE-991作用15 min，再加入20 μmol/L的瑞替加濱作用15 min。計算瑞替加濱加藥前后離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率。實驗重復6次，取平均值。

1.5 XE-991對瑞替加濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌收縮功能影響的觀察 另取一套實驗系統(tǒng)，待十二指腸腸管張力曲線穩(wěn)定后，先加入20 μmol/L的瑞替加濱作用15 min，再加入10 μmol/L的XE-991作用15 min。計算XE-991加藥前后離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率。實驗重復6次，取平均值。

2 結果

2.1 瑞替加濱對離體十二指腸腸管平滑肌張力的影響 0 μmol/L瑞替加濱作用下離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅(基線值)變化百分率為100%。在3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L瑞替加濱作用下離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率分別為(87.4±7.5)%、(70.9±3.9)%、(63.3±9.9)%、(39.0±11.3)%、(30.1±9.3)%、(14.6±2.7)%、(7.1±1.5)%、(8.1±2.8)%。3.125 μmol/L瑞替加濱作用下離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率與基線值相比，P>0.05。6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L瑞替加濱作用下，離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率均低于基線值，P均<0.05。在6.25～200 μmol/L范圍內，隨著瑞替加濱濃度提高，離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率逐漸下降，P均<0.05。

2.2 瑞替加濱對XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力的影響 瑞替加濱加藥前后XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率分別為(134.35±13.95)%、(122.28±16.98)%，二者相比P>0.05。

2.3 XE-991對瑞替加濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌收縮功能影響 XE-991加藥前后瑞替加濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅分別為(66.11±18.45)%、(86.24±18.80)%，XE-991加藥后瑞替加濱孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率高于XE-991加藥前，P均<0.05。

3 討論

研究證明，瑞替加濱參與調控血管、泌尿生殖系統(tǒng)等組織的平滑肌活性[6～8]。本研究結果顯示在6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L瑞替加濱作用下，離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅變化百分率均低于基線值。在6.25～200 μmol/L范圍內，隨著瑞替加濱濃度提高，平均振幅變化百分率逐漸下降，表明瑞替加濱對離體大鼠十二指腸平滑肌收縮具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。證實在大鼠離體十二指腸平滑肌中存在對瑞替加濱敏感的鉀離子通道，并且參與調控十二指腸平滑肌的收縮運動。

Kv7型鉀離子通道為電壓敏感型鉀離子通道的一種亞型，主要參與調控細胞膜去極化，從而影響細胞活性[9]。XE-991為非選擇性Kv7型鉀離子通道阻斷劑，研究表明， XE-991可增強胃腸道平滑肌、各種血管平滑肌、子宮平滑肌等[10]的收縮強度，其機制為阻斷細胞膜上的鉀離子通道，減少鉀離子外流，減小靜息膜電位，使細胞去極化，增強細胞興奮性；常作為研究鉀離子通道開放劑或者抑制劑相關性質實驗的工具藥。本研究采用10 μmol/L XE-991驗證瑞替加濱對大鼠十二指腸的抑制作用，結果顯示，瑞替加濱加藥前后XE-991孵育的離體十二指腸腸管平滑肌張力曲線的平均振幅無統(tǒng)計學差異。說明XE-991阻斷了瑞替加濱對十二指腸平滑肌收縮的抑制作用。由于XE-991是非選擇性鉀離子通道阻斷劑，故我們認為瑞替加濱對大鼠離體十二指腸腸管平滑肌收縮運動產生的抑制作用是通過激活鉀離子通道而實現(xiàn)的。而調換給藥順序，先給予瑞替加濱再給予XE-991，離體大鼠十二指腸腸管收縮幅度增加，表明XE-991可以逆轉瑞替加濱對離體大鼠十二指腸平滑肌收縮的抑制作用，進一步證實XE-991和瑞替加濱之間存在競爭性拮抗。Kv7型鉀離子通道含有5種亞型，即Kv7.1～7.5,目前已知在小鼠的胃底、胃竇、結腸、盲腸中各型均有表達，但表達量不同，其中Kv7.4、Kv7.5為優(yōu)勢亞型[10]。而在大鼠胃中只有Kv7.1～7.3通道表達，且主要分布在胃竇，在胃體分布較少?？梢娫诓煌瑒游?、不同組織中，Kv7各亞型的分布存在差異，各型在大鼠十二指腸中的分布和表達量尚不明確，需要進一步深入研究，確定調控十二指腸收縮運動的亞型。

綜上所述，瑞替加濱可抑制SD大鼠離體十二指腸收縮功能，其機制可能與激活鉀離子通道有關。該結果提示在十二指腸存在Kv7型鉀離子通道，參與調節(jié)十二指腸的運動功能，可能成為十二指腸運動障礙性疾病的治療靶點。

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Effect of retigabine on contraction of smooth muscle of rat duodenum in vitro

GAODi,CHENYuanjin,LIUYudan,ZHANGNan,SHALei

(SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

ObjectiveTo investigate the effect of retigabine on contraction of the smooth muscle of rat duodenum and to discuss its mechanism.MethodsThe rat duodenum was cut into segments with a length of about 1.5 cm. We used BL-420F Biological Function Experiment System for tension recording. After tension curve was stabilized, we performed the following experiments and each experiment was repeated 6 times. ① We added 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 150, 200 μmol/L of retigabine into the solution. The recording time of each concentration was 15 min and each concentration was rinsed with Kreb's solution for 20 min. The mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro was measured before administration and after treatment with different concentrations of retigabine. ② After 10 μmol/L XE-991 was added for 15 min, we added 20 μmol/L retigabine for 15 min. Then we compared the percent of mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro before and after retigabine. ③ After 20 μmol/L retigabine was added for 15 min, we added 10 μmol/L XE-991 for 15 min. Then we compared the percent of mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro before and after XE-991.Results① The percent of mean amplitude of the smooth muscle tension of duodenum in vitro before retigabine intervention was 100%. The percents of mean amplitude which were treated with retigabine were lower than that of the control group (0 μmol/L),P<0.05. In the range of 6.25-200 μmol/L, the percent of mean amplitude decreased gradually with the increase of retigabine concentration,P<0.05. ② The percent of mean amplitude of smooth muscle tension which was incubated by XE-991 did not change significantly before and after retigabine intervention,P>0.05.③ The percent of mean amplitude of smooth muscle tension which was incubated by retigabine was higher than that after being given XE-991,P<0.05.ConclusionIn the range of 6.25-200 μmol/L, retigabine can inhibit the contraction of rat duodenal smooth muscle in a dose-dependent manner, and this inhibitory effect may be due to the activation of potassium channel.

retigabine; duodenum; smooth muscle; contraction; potassium channel; in vitro experiment

國家自然科學基金資助項目(81270900，81670492)。

高迪(1988-)，女，助理實驗師，碩士，主要研究方向為胃腸動力學。E-mail： dgao@cmu.edu.cn。

沙磊(1964-)，男，教授，博士生導師，主要研究方向為胰腺神經系統(tǒng)及胃腸動力學。E-mail： lsha@cmu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.005

R742.1

A

1002-266X(2017)20-0017-03

2016-12-18)