何云，黃璀

(武漢市普愛(ài)醫(yī)院，武漢430000)

腎細(xì)胞癌是常見(jiàn)的實(shí)體腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率逐漸上升[1]。盡管早期、局限性的腎癌經(jīng)放療及手術(shù)治療后能取得較好的效果，但20%～40%的患者術(shù)后仍出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，中位生存期僅1.5年，生存期超過(guò)5年者僅不到10%[2～4]。因此，對(duì)于腎癌遷移及侵襲機(jī)制的研究已成為腎癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。中心體相關(guān)激酶2(Nek2)是一種與中心體結(jié)構(gòu)類(lèi)似的、具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白[5,6]。Nek2可通過(guò)穩(wěn)定微管中心體復(fù)制和分離過(guò)程、著絲粒附著和紡錘體組裝的檢查點(diǎn)等，對(duì)細(xì)胞周期發(fā)揮調(diào)控作用[7,8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Nek2可通過(guò)增加腫瘤形成、耐藥、侵襲等機(jī)制促進(jìn)乳腺癌[9]、肝癌[10]、肺癌[11]的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。但目前對(duì)Nek2在腎癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制尚不明確。2015年1月～2016年1月，我們觀(guān)察了下調(diào)Nek2表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498細(xì)胞遷移及侵襲的影響，探討Nek2在腎癌細(xì)胞遷移與侵襲中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及材料 人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；一抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；Nek2抑制劑INH6購(gòu)自北京愛(ài)普拜生物技術(shù)有限公司；DMEM、胰蛋白酶、FBS購(gòu)自美國(guó)Gibico公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將A498加入DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后傳代，將細(xì)胞分為觀(guān)察組、對(duì)照組，分別給予100 mmol/L的Nek2抑制劑INH6及等體積DMSO，培養(yǎng)14 h。

1.3 Nek2 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用q-RT-PCR法。使用TRIzol法提取A498細(xì)胞總RNA。設(shè)計(jì)引物序列：Nek2正義鏈5′-CATTGGCACAGGCTCCTAC-3′，反義鏈5′-GAGCCATAGTCAAGTTCTTTCCA-3′；GAPDH正義鏈5′-TATGCTCTCCTCATGCATTG -3′，反義鏈5′-GGGACG-ACCTTCGATCTACC-3′。按TAKARA SYBR Premix Ex Taq反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Nek2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Nek2蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。收集兩組細(xì)胞，加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以每孔20 μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳50 min，分離膠100 V電泳2 h，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Nek2(1∶500)和β-actin(1∶200)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗(1∶1 000)，ECL顯影，Quantity One 1-D分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡條帶進(jìn)行定量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白測(cè)定值/ β-actin。

1.5 細(xì)胞侵襲能力測(cè)定 采用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。兩組各取1×106個(gè)細(xì)胞，在Transwell上室加入細(xì)胞懸液200 μL，并設(shè)立3復(fù)孔，下室加入常規(guī)培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)600 μL，細(xì)胞侵襲14 h后，去除上室面細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后，使用顯微鏡在20倍視野下計(jì)算穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)評(píng)估侵襲能力變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞遷移能力測(cè)定 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將兩組細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，待細(xì)胞貼壁融合后，使用10 μL槍尖進(jìn)行劃痕，并在劃痕后0、24 h在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞劃痕修復(fù)情況，使用Wimscratch在線(xiàn)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率，劃痕愈合率=(劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。劃痕愈合率越高，表示細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 兩組Nek2 mRNA表達(dá)比較 對(duì)照組和觀(guān)察組Nek2 mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.01、0.22±0.01，觀(guān)察組Nek2 mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 兩組Nek2蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、觀(guān)察組Nek2蛋白表達(dá)量分別為1.56± 0.12、0.56± 0.10，觀(guān)察組Nek2蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.3 兩組侵襲能力比較 對(duì)照組、觀(guān)察組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(428.8±18.1)、(128.2±46.9)個(gè)，觀(guān)察組侵襲細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.4 兩組遷移能力比較 對(duì)照組、觀(guān)察組劃痕愈合率分別為86.3%±5.7%、53.2%±3.4%，觀(guān)察組劃痕愈合率低于對(duì)照組(P<0.01)。

3 討論

雖然腎癌對(duì)于放療與手術(shù)治療十分敏感，但腎癌轉(zhuǎn)移仍是影響患者生存的重要因素。目前對(duì)腎癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究主要集中于腎癌細(xì)胞侵襲潛能的改變[12]、胞外基質(zhì)降解增強(qiáng)[13]、血管形成[14]等方面。

Nek家族包括Nek1～11，其中Nek2與中心體的序列最為相似，Nek2位于染色體1q32.2-1q41[6]，Nek2的表達(dá)包括3個(gè)可變剪切體Nek2A、Nek2B和Nek2C，其中以Nek2A在腫瘤組織最常見(jiàn)[7]。盡管Nek2在進(jìn)化中處于相對(duì)保守，但其已被證實(shí)在多種腫瘤如肝癌[10]、前列腺癌[15]、卵巢癌[16]的侵襲、遷移中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Nek家族廣泛參與調(diào)節(jié)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程。在肝癌組織中，Nek2主要通過(guò)MAPK通路抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[10]；在前列腺癌組織中，Nek2通過(guò)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路改變細(xì)胞增殖[15]；在卵巢癌組織中，Nek2則通過(guò)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變SKOV3卵巢癌細(xì)胞系的生物學(xué)行為[16]。Nek2與腎細(xì)胞癌之間的聯(lián)系已有研究，使用基因富集分析乳頭狀腎細(xì)胞癌發(fā)現(xiàn)，染色體1q中的Nek2、KIF14等基因的富集以及表達(dá)量的增加與乳頭狀腎細(xì)胞癌的進(jìn)展密切相關(guān)，并在致死患者中的基因拷貝數(shù)顯著增加[17]。在肝癌中，Nek2的下調(diào)能夠抑制HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，同時(shí)抑制遷移[18]。Nek2也被認(rèn)為是一個(gè)重要的肝癌預(yù)后與進(jìn)展的標(biāo)記物。在結(jié)腸癌中，Nek2受到microRNA-128甲基化的調(diào)控，同時(shí)Nek2過(guò)表達(dá)的患者預(yù)后顯著變差[19]。Nek2對(duì)腫瘤的作用與其功能相關(guān)，在細(xì)胞分裂中，Nek2在有活性的狀態(tài)下能夠誘導(dǎo)不成熟的中心體分裂，從而使得中心粒的內(nèi)聚力喪失，Nek2在無(wú)活性狀態(tài)下則能夠?qū)е轮行捏w異常、單極紡錘體以及非整倍體的形成，以上均為導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[20]。低等真核生物與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Nek2過(guò)表達(dá)能夠使染色體呈5～10倍的增加，意味著多倍體的出現(xiàn)與異常染色體的出現(xiàn)[21]。因此Nek2是一種極其重要的癌基因。但Nek2與腎癌發(fā)病的關(guān)系尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，觀(guān)察組Nek2 mRNA及蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組，提示Nek2抑制劑INH6可顯著下調(diào)Nek2的表達(dá)；觀(guān)察組侵襲細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組、細(xì)胞劃痕愈合率低于對(duì)照組，提示Nek2下調(diào)表達(dá)可顯著抑制腎細(xì)胞癌的侵襲與遷移。

綜上所述， 抑制Nek2的表達(dá)能夠抑制腎癌細(xì)胞的侵襲與遷移，Nek2可能參與了腎癌侵襲與遷移的過(guò)程。