張業(yè)翠，吳鵬，武文，郭興瑩，王艷青，黃象艷

(濟南軍區(qū)總醫(yī)院， 濟南 250031)

ABO正反定型不符患者血型的血清學及基因測序鑒定(附1例報告)

張業(yè)翠，吳鵬，武文，郭興瑩，王艷青，黃象艷

(濟南軍區(qū)總醫(yī)院， 濟南 250031)

目的對1例ABO正反定型不符患者血型進行血清學及基因測序鑒定。方法選擇1例標準血型血清學方法(微柱凝膠卡+全自動血型配血分析儀)鑒定結果為ABO正反定型不符(正定型為O型，反定型為A型)患者，抽取其血液標本，采用試管法做進一步的血清學鑒定，包括正反定型復查、紅細胞吸收放散試驗；提取血液基因組DNA，采用PCR法擴增ABO基因第6、7外顯子并測序。結果試管法血清學表現為ABO血型正反定型不一致,正定型未檢測到A抗原和B抗原,反定型血清中存在抗-B及弱的抗-A；紅細胞做吸收放散試驗檢出A抗原，初定為A亞型。測序結果與A101參考序列相比較，發(fā)現Ax13亞型940位堿基A>G的亞型決定性基因突變。結論本例患者ABO血型疑似A亞型，ABO基因型為Ax13/O01，第七外顯子940位A>G突變導致A抗原表達減弱。

ABO血型；Ax13亞型；基因測序；基因突變

血型是指血液成分(包括紅細胞、白細胞、血小板)表面的抗原類型，是血液中各種成分的遺傳多態(tài)性標志，通常所說的血型是指紅細胞膜上特異性抗原類型。國際輸血學會已經在人類中正式報告了屬于36個血型系統(tǒng)的300多種紅細胞抗原[1]。ABO血型是臨床輸血醫(yī)學中最重要的紅細胞血型系統(tǒng)之一，涉及臨床安全輸血、器官移植、醫(yī)學遺傳學等領域[2]。ABO血型系統(tǒng)除正常的 A、B、O、AB這4 種血型外，還具有多個亞型，表現為抗原明顯減弱或正反定型不一致。ABO亞型的主要發(fā)生原因是ABO基因編碼區(qū)的突變，包含點突變、缺失突變等[3]。對于常規(guī)血清學檢測不能確定的血型，應該行ABO基因測序分型。本研究采用標準血清學鑒定和ABO基因測序的方法鑒定1例血清學實驗正反定型不符的疑難血型標本，并分析Ax亞型的血清學特征和基因序列特征?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者男，34歲。體外受精術前采用標準血型血清學方法(微柱凝膠卡+全自動血型配血分析儀)鑒定血型，結果為ABO正反定型不符(正定型為O型，反定型為A型)。本研究已獲我院醫(yī)學倫理委員會批準。患者對本研究知情同意且已經簽署知情同意書。

1.2 ABO血型血清學鑒定方法 ①試管法ABO正反定型[4]：取潔凈小試管6只，標明抗-A、抗-B、AC、BC、OC、自身C，標記有抗-A、抗-B字樣的小試管分別加入抗A、抗B標準血清各1滴及被檢者5%三洗紅細胞生理鹽水懸液各1滴；標記有AC、BC、OC字樣的小試管分別加入相應的5%試劑ABO細胞各1滴及被檢者血清各2滴，標記有自身C字樣的小試管加入被檢者5%三洗紅細胞生理鹽水懸液l滴及血清2滴，以上各管均充分混勻，放入血型血清學專用離心機以1 000×g離心15 s，判讀結果。②紅細胞吸收和放散試驗：取患者三洗壓積紅細胞1 mL，加等量單克隆抗-A試劑混勻，置于4 ℃環(huán)境中吸收1 h ，然后用冷鹽水洗滌8次，再加等量常溫的生理鹽水混勻，放入56 ℃熱放散10 min后離心取放散液。用低離子抗人球卡將放散液與A試劑紅細胞反應，并將最后一次離心洗滌后的上清液作為平行對照，孵育離心觀察結果。

1.3 ABO基因測序方法 抽取患者外周靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中, 使用TIANamp血液DNA提取試劑盒, 按步驟提取全血DNA，用外顯子6、7擴增試劑盒和PCR法擴增ABO基因外顯子6和7，將PCR產物送上海生工生物工程公司進行直接測序。將測序結果與紅細胞基因序列數據庫中的ABO等位基因進行比對，確定亞型。

2 結果

2.1 血清學鑒定結果 試管法復查血型，室溫條件下結果與微柱凝膠法結果一致。正定型患者紅細胞與抗-A、抗-B標準血清均無凝集；與抗-AB反應凝集強度為++；與抗H反應凝集強度為++++；反定型患者血清與標準反定細胞AC、OC均無凝集，與BC凝集強度為++++，自身對照為陰性。反定型放4 ℃ 10 min后立即離心，結果顯示血清中除檢出有較強的抗-B外，還檢出弱的抗-A(凝集強度為+/-)；4 ℃ 30 min后再次離心抗-A凝集強度較前有所增強(凝集強度為++)。血清學格局呈現A亞型。吸收放散試驗放散液與A試劑紅細胞呈陽性反應，最后一次離心洗滌后的上清液與A試劑紅細胞呈陰性反應。

2.2 基因測序結果 外顯子6存在261位缺失突變，為O01型一般性特征性突變；外顯子7出現第940位A>G突變，為Axl3亞型決定性突變。結合外顯子6和外顯子7測序結果，確定受檢標本的基因型為Axl3/O01。

3 討論

正確的血型鑒定是保證臨床輸血安全的關鍵。因此，如何正確鑒定常規(guī)血清學檢測中正反定型不符的血型標本至關重要。ABO亞型是引起血型正反定型不符的常見原因之一，其判定標準往往是根據紅細胞和抗體反應強度、H抗原強度、吸收放散能力等進行[5]。本研究該例患者血清學實驗顯示為A亞型，血清學檢測結果顯示為疑似Ael亞型或Ax亞型。Ax亞型是ABO亞型中一種弱表現型，Ax表現型具有高度的遺傳異質性，其主要血清學特征是: Ax亞型紅細胞與來源于B型個體血清中的抗-A呈弱凝集反應或不凝集，與來源于O型個體血清中抗-AB的反應增強，血清中常含有弱的抗-A，與抗-H的凝集強度都近似于O型，顯示強凝集[6，7]。Ax亞型與Ael亞型有相似之處，Ael 亞型是另一種較為罕見的ABO亞型，其紅細胞通常條件下與抗-A、抗-AB血清試劑不發(fā)生凝集，H抗原的含量比B型紅細胞高，接近O型紅細胞，A抗原表達量極弱，往往需要通過吸收放散試驗才能檢出[8，9]。本研究中該例患者血清學實驗結果顯示紅細胞與抗AB凝集++，與抗H凝集++++，經吸收放散試驗檢出A抗原；反定型在4 ℃10 min檢出較強的抗-B及弱的抗-A，4 ℃ 30 min后抗-A凝集強度較前有所增強凝集強度為++，推測該血型可能為Ax亞型。由于Ax亞型與Ael亞型之間只表現為極少的血型血清學差異,為進一步確定該患者亞型，我們對ABO基因進行測序以確定其亞型。

ABO血型系統(tǒng)基因位于9號染色體，由7個外顯子和6個內含子組成，其中ABO基因型多態(tài)性集中在6、7外顯子片段。所以我們對ABO基因第 6、7 外顯子和第6 內含子的核苷酸序列進行了測序。結果顯示，外顯子6存在261位缺失突變，為O01型一般性特征性突變；外顯子7出現第940位A>G突變，經檢索國際血型抗原突變庫，940位A>G突變基因為Axl3[10]，940位堿基突變只有在Axl3等位基因中發(fā)現。α1，3-N-乙酰半乳糖胺基轉移酶基因940位A>G突變使314位賴氨酸變成谷氨酸，進而導致A抗原表達減弱。自從1993年報道了世界首例Ax等位基因[11]以來，在不同地區(qū)和人群中陸續(xù)發(fā)現25個Ax等位基因，Cai等[12]在2013年報道了Axl3等位基因。突變導致的A抗原弱表達易使弱A錯判為O型，造成血型鑒定錯誤。

血型鑒定在輸血工作中占有極其重要的地位，是輸血治療的首要步驟。除此之外，ABO血型在心血管疾病中的風險相關性研究[13]和與腫瘤患者預后相關性的研究[14]也越來越受到關注。因此，血型鑒定的準確與否是臨床輸血安全和其他臨床相關研究最為關鍵的一步。除了常見的典型ABO表型外，已經發(fā)現許多ABO亞型在紅細胞上具有弱表達的A或B抗原，這使得血型分型越來越困難，往往呈現ABO正反定型不一致。遇到ABO正反定型不符的標本，首先需要通過重新采集血樣和重復規(guī)范操作來排除操作不規(guī)范等因素的影響，然后需要通過實驗排除弱抗原和(或)弱抗體的漏檢，找到科學合理的解釋，最終通過血清學特征初步判定血型。

血清學方法是血型鑒定的經典方法，適用于日常的血型定型工作。當遇到血型正反定型不一致時，可以通過敏感的吸收放散試驗和血型物質檢測證實抗原的存在，通過4 ℃加強試驗證實抗體。當然，在亞型鑒定時僅采用血清學方法鑒定是有一定局限性的，同樣是A亞型，在基因測序時就有可能會出現Ax、Ael等不同的基因型或同一亞型的不同分型。基因測序可以對患者血型進行基因分型，并有可能發(fā)現新的突變位點、探討疑難血型的發(fā)生機制，是對血清學鑒定方法的有效且重要的補充[10]。因此，在血型鑒定工作中將兩種方法有效結合，對于正確鑒定疑難血型和保證臨床安全輸血具有重要意義。

[1] Raud L, Férec C, Fichou Y. From genetic variability to phenotypic expression of blood group systems[J]. Transfus Clin Biol, 2017,[Epub ahead of print].

[2] Cooling L. Blood Groups in Infection and Host Susceptibility[J]. Clin Microbiol Rev, 2015,28(3):801-807.

[3] Yamamoto F. Molecular genetics of ABO[J]. Vox Sang, 2000,78(Suppl 2)：91-103.

[4] 輸血技術操作規(guī)程(輸血科部分)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2016:16-17.

[5] 王憬惺.輸血技術[M].3 版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2013：341-343.

[6] 錢江.AX亞型中發(fā)現1個新突變位點[J].中國輸血雜志,2014,27(5):514-515.

[7] 蔡曉紅，金沙，劉曦，等.中國人群ABO亞型中一個新的Ax等位基因的鑒定[J].臨床血液學雜志，2009,6(6)：309-312.

[8] 劉培燕, 韓斌, 王明民, 等.Ael 亞型血清學及基因型分析一例[J].中國輸血雜志,2015,28(5):581-583.

[9] 丁琴麗, 凌止發(fā),賴蜜, 等.一例罕見 Ael08的血清學鑒定及基因測序[J].中國輸血雜志,2017,30(2):197-198.

[10] Patnaik SK, Helmberg W, Blumenfeld OO. BGMUT: NCBI dbRBC database of allelic variations of genes encoding antigens of blood group systems[J]. Nucleic Acids Res, 2012,40(Database issue):D1023-D1029.

[11] Yamamoto F， Mc Neill PD. Yamamoto M， et al. Molecular genetic analysis of the AB0 blood group system： 3.A(X) and B(A)alleles[J]. Vox Sang， 1993，64(3)：171-174.

[12] Cai X, Jin S, Liu X, et al. Molecular genetic analysis of ABO blood group variations reveals 29 novel ABO subgroup alleles[J]. Transfusion， 2013，53(11 Suppl 2)：2910-2916.

[13] He M, Wolpin B, Rexrode k, et al. ABO blood group and risk of coronary heart disease in two prospective cohort studies[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012,32(9):2314-2320.

[14] Franchini M, Liumbruno GM, Lippi G. The prognostic value of ABO blood group in cancer patients[J]. Blood Transfus, 2016,14(5):434-440.

黃象艷(E-mail： xiangyan73@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.013

R446.6

B

1002-266X(2017)40-0048-03

2017-04-30)