王 敏

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115200)

SSR和ISSR技術在植物病原真菌研究中的應用

王 敏

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115200)

本文介紹了SSR和ISSR技術的原理，并從植物抗病基因的鑒定，病原真菌群體遺傳和生理小種鑒定，病原菌致病性研究和遺傳多樣性研究等4個方面綜述了這兩種技術在植物病原真菌研究中的應用情況。

SSR；ISSR；植物病原真菌

分子標記技術是隨著分子生物學的發(fā)展而產生的一種先進研究技術，它是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。該技術發(fā)展至今已經產生了多種適合不同條件的分子標記技術，如限制性片斷長度的多態(tài)性標記(RFLP)、簡單序列重復標記(SSR)、隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、擴展片段長度多態(tài)性標記(AFLP)和簡單重復間序列標記(ISSR)等。通過對常用分子標記技術特性的比較[1]，發(fā)現(xiàn)SSR技術和ISSR技術相對于其他技術所需DNA量少，標記數(shù)量豐富，而且分布均勻，實驗重復性好，技術難度和實驗成本低等優(yōu)點。因此本文從植物抗病基因的鑒定；病原真菌群體遺傳和生理小種鑒定；病原菌致病性研究；遺傳多樣性研究4個方面綜述了這兩種技術在植物病原真菌研究中的應用情況。

1 技術介紹

SSR(Simple Sequence Repeat)標記是近年發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術，也稱為微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個堿基(一般為1～6個)組成的基序串聯(lián)重復而成的DNA序列。由于不同等位基因間的重復數(shù)存在差異且SSR兩側的序列多是相對保守的單拷貝序列，因此可通過特異引物對基因組總DNA進行PCR擴增，擴增片段的長度多態(tài)性可用作分子標記。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)標記是在SSR基礎上發(fā)展起來的新型分子標記。該技術以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的5′或3′端加錨2～4個隨機核苷酸，在PCR反應中，錨定引物可以引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA片段進行PCR擴增。該技術避免了引物在基因組上的滑動，大大提高了PCR擴增的專一性。ISSR技術的引物設計比SSR技術簡單，不需要知道DNA序列即可擴增，又可以提示比RAPD、SSR更豐富的多態(tài)性[2]。

2 SSR、ISSR分子標記在植物病原真菌研究中的應用

隨著分子生物技術的發(fā)展，SSR、ISSR技術逐漸應用到植物病原真菌的研究中。這兩項技術在植物真菌病害的研究中主要應用于：(1)植物抗病基因的鑒定；(2)病原真菌群體遺傳和生理小種鑒定；(3)病原菌致病性研究；(4)遺傳多樣性研究。

2.1 用于植物抗病基因的鑒定

2003年M.Cakir等人[3]采用SSR、AFLP、RFLP分子標記方法對大麥進行基因繪圖來獲得條銹病的抗病基因。LIU Shi-Ping等人[4]應用SSR和ISSR分子標記輔助選擇大米抗稻瘟病病菌基因，用于珍汕97大米的培育。杜威世等[5]利用SSR分子標記，以海島棉*陸地棉為雜交親本，利用其F2代尋找與黃萎病抗性基因有關的標記檢測，為分子標記輔助選擇育種奠定基礎。J.M.Musial等人[6]使用了50個RAPD，104個AFLP和1個SSR標記構建了紫花苜蓿的抗疫霉根腐病基因的基因連鎖圖。這個基因連鎖圖能夠為將來在分子水平上改進澳大利亞紫花苜蓿提供了落腳點。李韜等人[7]利用AFLP和SSR標記以及非整倍體分析對目的基因進行染色體定位和遺傳作圖，來獲得有利抗性基因資源用以培育抗白粉病小麥品種。孟英等人[8]介紹了SSR的機理，闡述了SSR技術對水稻抗稻瘟病研究的作用，為抗稻瘟病的分子遺傳機理研究奠定了基礎。馬驥超等人[9]綜述了SSR標記在小麥抗病QTL分析、抗病基因標記和定位等方面的應用情況。M.J.Christopher等人[10]采用SSR標記技術結合QTLs技術來確認小麥抗黑點病基因，結果表明標記協(xié)助的QTLs抗黑點病基因的定位能夠增加選擇的效率并利用從不同的來源中獲取黑點病抗性基因。H.Muranty等人[11]采用微衛(wèi)星和AFLP標記對冬小麥品系RE714抗白粉病基因進行探測，發(fā)現(xiàn)有3個主要的QTLs被微衛(wèi)星標記所強化，并應用于QTLs的選擇。Julie Gold等人[12]通過ISSR法為培育小麥抗銹病基因Sr39和Lr35開發(fā)了分子標記。Mucella Tekeoglu等人[13](2000年)采用ISSR標記、RAPD標記等多種分子標記法確定了尖鐮孢菌0-5號小種的抗性基因在基因圖譜中的位置，然后評定了這兩種基因的連鎖關系及其與其他所知抗萎焉病基因的關系。張立榮[14]利用ISSR技術對Thatcher及22個以Thatcher為輪回親本的小麥抗葉銹病近等基因系(NILs)進行分析，構建了一個適宜小麥ISSR分析的最優(yōu)體系。并通過分析找到了一個與Lr37基因連鎖的ISSR標記。康榮華等人[15]對開發(fā)SSR技術的兩種方法從基本原理和主要步驟兩個方面進行了介紹，總結了SSR技術的特點并對其在作物遺傳圖譜構建、品種鑒定及分子標記輔助育種等方面進展情況進行了綜述。

2.2 用于病原真菌群體遺傳和生理小種鑒定

Tarakanta JANA 等人[16]應用SSR標記技術對從大豆和棉花中獲取的菜豆殼球孢菌的種群基因多態(tài)性進行了分析。證明了微衛(wèi)星技術在種群研究中的作用并為將來使用診斷標記來診斷大豆和棉花病害邁出有力的一步。Claudia Kaye等人[17]對造成大米枯萎病的絲狀子囊菌稻瘟病菌包含SSR位點進行了鑒定和描述，并將那些標記添加到完整基因圖譜上。Haydar Karaoglu等人[18]對9種分類學上不同的真菌基因組中SSR進行了發(fā)生情況、相對豐度、相對密度、普遍性和SSR長度比較分析，研究所得信息可以用作真菌種群基因和變種的鑒定研究。Kaspar Schwarzenbach等人[19]基于SSR標記基因型來探測監(jiān)控從土壤中提取的真菌種群及其變化，證明方法可行。Treena Burgess等人[20]采用SSR和ISSR技術對取自樹木上的內生真菌進行基因多態(tài)性擴增來獲取供分類學和群體研究的大量的多態(tài)性標記。ZHOU Shiguo等人[21]應用ISSR指紋技術來區(qū)分葡萄座腔菌屬種群及相關的變形真菌，實驗表明ISSR技術是區(qū)分極相似真菌極有利的手段。H?vard Kauserud等人[22]采用PCR-RFLPs，ISSR及雜交研究評估了芬諾斯堪迪亞木腐病的11種冷杉附毛孔菌的地理性類群。Maria M.Geldenhuis等人[23]采用ISSR分子標記法對煙草根黑腐病菌進行多態(tài)性擴增獲得特異性引物，這些引物能夠應用到重要病原的研究中去，并對世界上不同地區(qū)群體結構進行分析。Renbing Zhang等人[24](2004年)采用西瓜的117個由高品質自交系97103與鐮刀菌枯萎病菌雜交的重組自交系建立了遺傳連鎖圖譜，遺傳連鎖圖譜包括87個RAPD標記，13個ISSR標記和4個SCAR標記。這個圖譜的建立有助于將來對抗枯萎萎焉病菌基因定位的研究。Bernard Slippers等人[25]通過一系列的實驗從形態(tài)學、培養(yǎng)上和多等位基因DNA序列數(shù)據上對Botryosphaeria dothidea,B.ribis和B.parva在形態(tài)上進行了區(qū)分，并依據分子標記法對分類進行了證實，用ISSR標記的結果再次被證明它可以進行真菌種的鑒定。H?vard Kauserud[26]采用ISSR分子標記法對采自歐洲的干腐真菌Serpula lacrymans進行了分析，證明了5種常見的VCG都屬于S.lacrymans種群，并且提出ISSR方法足以區(qū)分極接近的真菌種。Christoph R.Grünig等人[27]采用ISSR，RFLP和ITS技術對分布廣泛的根部共生體Acephala applanata gen.et sp.Nov進行了分子描述，并對其進行了區(qū)分。并證明了ISSR-PCR指紋法只能同其他診斷手段一起來做種的鑒定。Shen Jie等人[28]采用ISSR分子標記法用從76個ISSR引物中選取的10個引物來對8個種群的鐵皮石斛進行了鑒別。李海蓮[29]對不同地區(qū)的14個茄子黃萎病菌進行了ISSR指紋分析，建立了高效的茄子大麗輪枝菌的ISSR反應體系，并對ISSR多態(tài)性的擴增及其與不同地理來源、形態(tài)類型、致病力和落葉型之間的關系進行了探討。Prashant K.Mishra等人[30]采用IGS區(qū)位和ISSR分子標記兩種方法對加拿大艾爾貝塔省和薩斯喀徹溫省的小麥中分離的小麥冠腐病菌進行種群間基因多樣性分析，研究表明兩省分離菌的基因多態(tài)性，但是在群體中表現(xiàn)低的基因區(qū)別和基因流動性。YU Zhong-dong等人[31]為比較Melampsoralarici-populinaITS的不同，通過調查從中國及其他國家分離的Melampsoralarici-populinaITS序列和ITS多基因樹，還通過ISSR方法來研究它們的基因分化。結果表明ITS區(qū)域是保守的，不適于研究已經存在于種之間的區(qū)別，而ISSR標記可以用來進行種內種群研究。馮淑杰等人[32]研發(fā)了一套基于稻瘟病菌測序菌株70～15全基因族序列的121個微衛(wèi)星標記，利用這些標記對無毒基因AvrPi7位點進行了連鎖分析。Nguyen Anh Nghia等人[33]應用形態(tài)學特征及ISSR標記技術對從馬來西亞橡膠園中分離的21種橡膠棒孢霉葉斑病菌進行了分類。

2.3 用于病原菌致病性研究

姜占發(fā)[34]應用ISSR技術對我國主要棉區(qū)大麗輪枝菌進行分子指紋分析，將供試的28株大麗輪枝菌分為SISG1、SISG2、SISG3、SISG4、SISG5、SISG6、SISG7共7個亞群，結果表明：每個亞群致病力與ISSR多態(tài)性表現(xiàn)出相關性；多態(tài)性、致病力與地理來源均未表現(xiàn)出相關性。馬鴻文等人[35]采用ISSR技術，研究了7個不同菌株的多態(tài)性、致病力分化和地理來源的關系。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿褐斑病具有豐富的遺傳多樣性，不同地理來源的菌株有明顯的遺傳分化現(xiàn)象，菌株的致病力差異與ISSR遺傳聚類組群的劃分有一定的相關性，但與地理來源沒有明顯的相關性。

2.4 遺傳多樣性研究等方面

MENG Xiangqi等人[36]采用AFLP和ISSR技術對從豆科植物中分離的46種大豆莖褐腐病菌進行了基因多樣性探測，并證明ISSR技術對該種菌的探測比AFLP技術更加經濟有效。張勇等人[37]l利用SSR技術對以望水白/安農8455的一粒傳產生的重組自交系進行對抗赤霉病QTLs的篩選，結果發(fā)現(xiàn)：75個引物在兩親本間有高達32.47%的多態(tài)性，其中5個引物在兩個親本和抗、感病間均有相同的多態(tài)性。Regina S.Redman等人[38]使用SSR標記等方法對生長于太平洋東北部奧林匹克半島的Cantharellus formosus的群體基因性狀進行分析。Cyril Dutech等人[39]應用SSR等分子手段對實驗中所得的多態(tài)性是否是從真菌中所獲得，進行了論證。杜青等人[40]利用SSR技術對抗疫霉根腐病的大豆品種(系)進行了遺傳多樣性分析，結果表明：抗疫霉根腐病大豆品種(系)間的遺傳差異較大，通過聚類分析將166個品種分為6類。姚國勝等人[41]利用Pi4B和Pi4G兩個引物對來自河北和黑龍江省的58個馬鈴薯晚疫病菌株基因組DNA進行了SSR基因型鑒定，分析了其遺傳多樣性。該研究完善了晚疫病菌研究的分子標記體系。賈少鋒等人[42]建立了小麥白粉病的ISSR擴增體系，明確了各引物的退火溫度，篩選出一些多態(tài)性較好的ISSR引物，并對小麥白粉病的遺傳多樣性和菌株毒性的關系進行了比較和分析。何瑞等人[43]確立了鐮刀菌的ISSR-PCR的最適反應條件，對27株鐮刀菌進行ISSR的遺傳多態(tài)性分析，結果表明，供試的27株鐮刀菌可分為3大類，兩個亞類，并對它們的親緣關系進行了分析。王子迎等[44]采用ISSR技術對來自中國黑龍江省、福建省和美國的3個大豆疫霉地理群體的遺傳多樣性進行了分析，研究了中國和美國大豆疫霉的遺傳關系。

3 結束語

SSR和ISSR標記發(fā)展至今，已經是十分成熟的標記技術。實踐證明，它們可以被應用于許多研究領域中，是可靠高效的標記技術。尤其是ISSR技術無需預先克隆和測序，而且多態(tài)性較高，信息量大，是一種應用前景廣泛的DNA標記技術。今后，可擴大其應用范圍，例如將其應用在動植物遺傳育種領域，生藥研究開發(fā)領域；就分析標記本身，其發(fā)展也是無止境的，可以朝著多引物，通用引物方向發(fā)展，在加強經典DNA標記技術的完善與改進，另一方面加快新型DNA標記的開發(fā)，使分子標記技術向著簡便，快速，準確的方向發(fā)展。

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Application of SSR and ISSR Techniques in the Study of Plant Pathogenic Fungi

WANG Min

(Poplar Institute of Liaoning Province,Gaizhou 115200,China)

In this paper a description is given of the principle of SSR and ISSR technology,and the application of these two technologies is summarized in researches on plant pathogenic fungi from the identification of plant disease resistant gene,pathogenic fungi population genetic and small-kind physiological identification,pathogen pathogenicity research and genetic diversity.

SSR,ISSR,Plant pathogenic fungi

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.01.010

2016-11-25

國家林業(yè)局“948”項目(2014-4-02)。

王敏(1974-)，女，遼寧蓋州人，本科，高級工程師,從事林業(yè)技術工作。

S763.15

A

1003-5508(2017)01-0046-05