王 敏

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115200)

SSR和ISSR技術(shù)在植物病原真菌研究中的應(yīng)用

王 敏

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115200)

本文介紹了SSR和ISSR技術(shù)的原理，并從植物抗病基因的鑒定，病原真菌群體遺傳和生理小種鑒定，病原菌致病性研究和遺傳多樣性研究等4個(gè)方面綜述了這兩種技術(shù)在植物病原真菌研究中的應(yīng)用情況。

SSR；ISSR；植物病原真菌

分子標(biāo)記技術(shù)是隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而產(chǎn)生的一種先進(jìn)研究技術(shù)，它是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。該技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)產(chǎn)生了多種適合不同條件的分子標(biāo)記技術(shù)，如限制性片斷長度的多態(tài)性標(biāo)記(RFLP)、簡單序列重復(fù)標(biāo)記(SSR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、擴(kuò)展片段長度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)和簡單重復(fù)間序列標(biāo)記(ISSR)等。通過對常用分子標(biāo)記技術(shù)特性的比較[1]，發(fā)現(xiàn)SSR技術(shù)和ISSR技術(shù)相對于其他技術(shù)所需DNA量少，標(biāo)記數(shù)量豐富，而且分布均勻，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，技術(shù)難度和實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。因此本文從植物抗病基因的鑒定；病原真菌群體遺傳和生理小種鑒定；病原菌致病性研究；遺傳多樣性研究4個(gè)方面綜述了這兩種技術(shù)在植物病原真菌研究中的應(yīng)用情況。

1 技術(shù)介紹

SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記是近年發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)堿基(一般為1～6個(gè))組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列。由于不同等位基因間的重復(fù)數(shù)存在差異且SSR兩側(cè)的序列多是相對保守的單拷貝序列，因此可通過特異引物對基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的長度多態(tài)性可用作分子標(biāo)記。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)標(biāo)記是在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記。該技術(shù)以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的5′或3′端加錨2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可以引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該技術(shù)避免了引物在基因組上的滑動，大大提高了PCR擴(kuò)增的專一性。ISSR技術(shù)的引物設(shè)計(jì)比SSR技術(shù)簡單，不需要知道DNA序列即可擴(kuò)增，又可以提示比RAPD、SSR更豐富的多態(tài)性[2]。

2 SSR、ISSR分子標(biāo)記在植物病原真菌研究中的應(yīng)用

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，SSR、ISSR技術(shù)逐漸應(yīng)用到植物病原真菌的研究中。這兩項(xiàng)技術(shù)在植物真菌病害的研究中主要應(yīng)用于：(1)植物抗病基因的鑒定；(2)病原真菌群體遺傳和生理小種鑒定；(3)病原菌致病性研究；(4)遺傳多樣性研究。

2.1 用于植物抗病基因的鑒定

2003年M.Cakir等人[3]采用SSR、AFLP、RFLP分子標(biāo)記方法對大麥進(jìn)行基因繪圖來獲得條銹病的抗病基因。LIU Shi-Ping等人[4]應(yīng)用SSR和ISSR分子標(biāo)記輔助選擇大米抗稻瘟病病菌基因，用于珍汕97大米的培育。杜威世等[5]利用SSR分子標(biāo)記，以海島棉*陸地棉為雜交親本，利用其F2代尋找與黃萎病抗性基因有關(guān)的標(biāo)記檢測，為分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。J.M.Musial等人[6]使用了50個(gè)RAPD，104個(gè)AFLP和1個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建了紫花苜蓿的抗疫霉根腐病基因的基因連鎖圖。這個(gè)基因連鎖圖能夠?yàn)閷碓诜肿铀缴细倪M(jìn)澳大利亞紫花苜蓿提供了落腳點(diǎn)。李韜等人[7]利用AFLP和SSR標(biāo)記以及非整倍體分析對目的基因進(jìn)行染色體定位和遺傳作圖，來獲得有利抗性基因資源用以培育抗白粉病小麥品種。孟英等人[8]介紹了SSR的機(jī)理，闡述了SSR技術(shù)對水稻抗稻瘟病研究的作用，為抗稻瘟病的分子遺傳機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。馬驥超等人[9]綜述了SSR標(biāo)記在小麥抗病QTL分析、抗病基因標(biāo)記和定位等方面的應(yīng)用情況。M.J.Christopher等人[10]采用SSR標(biāo)記技術(shù)結(jié)合QTLs技術(shù)來確認(rèn)小麥抗黑點(diǎn)病基因，結(jié)果表明標(biāo)記協(xié)助的QTLs抗黑點(diǎn)病基因的定位能夠增加選擇的效率并利用從不同的來源中獲取黑點(diǎn)病抗性基因。H.Muranty等人[11]采用微衛(wèi)星和AFLP標(biāo)記對冬小麥品系RE714抗白粉病基因進(jìn)行探測，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)主要的QTLs被微衛(wèi)星標(biāo)記所強(qiáng)化，并應(yīng)用于QTLs的選擇。Julie Gold等人[12]通過ISSR法為培育小麥抗銹病基因Sr39和Lr35開發(fā)了分子標(biāo)記。Mucella Tekeoglu等人[13](2000年)采用ISSR標(biāo)記、RAPD標(biāo)記等多種分子標(biāo)記法確定了尖鐮孢菌0-5號小種的抗性基因在基因圖譜中的位置，然后評定了這兩種基因的連鎖關(guān)系及其與其他所知抗萎焉病基因的關(guān)系。張立榮[14]利用ISSR技術(shù)對Thatcher及22個(gè)以Thatcher為輪回親本的小麥抗葉銹病近等基因系(NILs)進(jìn)行分析，構(gòu)建了一個(gè)適宜小麥ISSR分析的最優(yōu)體系。并通過分析找到了一個(gè)與Lr37基因連鎖的ISSR標(biāo)記。康榮華等人[15]對開發(fā)SSR技術(shù)的兩種方法從基本原理和主要步驟兩個(gè)方面進(jìn)行了介紹，總結(jié)了SSR技術(shù)的特點(diǎn)并對其在作物遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定及分子標(biāo)記輔助育種等方面進(jìn)展情況進(jìn)行了綜述。

2.2 用于病原真菌群體遺傳和生理小種鑒定

Tarakanta JANA 等人[16]應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)對從大豆和棉花中獲取的菜豆殼球孢菌的種群基因多態(tài)性進(jìn)行了分析。證明了微衛(wèi)星技術(shù)在種群研究中的作用并為將來使用診斷標(biāo)記來診斷大豆和棉花病害邁出有力的一步。Claudia Kaye等人[17]對造成大米枯萎病的絲狀子囊菌稻瘟病菌包含SSR位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定和描述，并將那些標(biāo)記添加到完整基因圖譜上。Haydar Karaoglu等人[18]對9種分類學(xué)上不同的真菌基因組中SSR進(jìn)行了發(fā)生情況、相對豐度、相對密度、普遍性和SSR長度比較分析，研究所得信息可以用作真菌種群基因和變種的鑒定研究。Kaspar Schwarzenbach等人[19]基于SSR標(biāo)記基因型來探測監(jiān)控從土壤中提取的真菌種群及其變化，證明方法可行。Treena Burgess等人[20]采用SSR和ISSR技術(shù)對取自樹木上的內(nèi)生真菌進(jìn)行基因多態(tài)性擴(kuò)增來獲取供分類學(xué)和群體研究的大量的多態(tài)性標(biāo)記。ZHOU Shiguo等人[21]應(yīng)用ISSR指紋技術(shù)來區(qū)分葡萄座腔菌屬種群及相關(guān)的變形真菌，實(shí)驗(yàn)表明ISSR技術(shù)是區(qū)分極相似真菌極有利的手段。H?vard Kauserud等人[22]采用PCR-RFLPs，ISSR及雜交研究評估了芬諾斯堪迪亞木腐病的11種冷杉附毛孔菌的地理性類群。Maria M.Geldenhuis等人[23]采用ISSR分子標(biāo)記法對煙草根黑腐病菌進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增獲得特異性引物，這些引物能夠應(yīng)用到重要病原的研究中去，并對世界上不同地區(qū)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。Renbing Zhang等人[24](2004年)采用西瓜的117個(gè)由高品質(zhì)自交系97103與鐮刀菌枯萎病菌雜交的重組自交系建立了遺傳連鎖圖譜，遺傳連鎖圖譜包括87個(gè)RAPD標(biāo)記，13個(gè)ISSR標(biāo)記和4個(gè)SCAR標(biāo)記。這個(gè)圖譜的建立有助于將來對抗枯萎萎焉病菌基因定位的研究。Bernard Slippers等人[25]通過一系列的實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)上和多等位基因DNA序列數(shù)據(jù)上對Botryosphaeria dothidea,B.ribis和B.parva在形態(tài)上進(jìn)行了區(qū)分，并依據(jù)分子標(biāo)記法對分類進(jìn)行了證實(shí)，用ISSR標(biāo)記的結(jié)果再次被證明它可以進(jìn)行真菌種的鑒定。H?vard Kauserud[26]采用ISSR分子標(biāo)記法對采自歐洲的干腐真菌Serpula lacrymans進(jìn)行了分析，證明了5種常見的VCG都屬于S.lacrymans種群，并且提出ISSR方法足以區(qū)分極接近的真菌種。Christoph R.Grünig等人[27]采用ISSR，RFLP和ITS技術(shù)對分布廣泛的根部共生體Acephala applanata gen.et sp.Nov進(jìn)行了分子描述，并對其進(jìn)行了區(qū)分。并證明了ISSR-PCR指紋法只能同其他診斷手段一起來做種的鑒定。Shen Jie等人[28]采用ISSR分子標(biāo)記法用從76個(gè)ISSR引物中選取的10個(gè)引物來對8個(gè)種群的鐵皮石斛進(jìn)行了鑒別。李海蓮[29]對不同地區(qū)的14個(gè)茄子黃萎病菌進(jìn)行了ISSR指紋分析，建立了高效的茄子大麗輪枝菌的ISSR反應(yīng)體系，并對ISSR多態(tài)性的擴(kuò)增及其與不同地理來源、形態(tài)類型、致病力和落葉型之間的關(guān)系進(jìn)行了探討。Prashant K.Mishra等人[30]采用IGS區(qū)位和ISSR分子標(biāo)記兩種方法對加拿大艾爾貝塔省和薩斯喀徹溫省的小麥中分離的小麥冠腐病菌進(jìn)行種群間基因多樣性分析，研究表明兩省分離菌的基因多態(tài)性，但是在群體中表現(xiàn)低的基因區(qū)別和基因流動性。YU Zhong-dong等人[31]為比較Melampsoralarici-populinaITS的不同，通過調(diào)查從中國及其他國家分離的Melampsoralarici-populinaITS序列和ITS多基因樹，還通過ISSR方法來研究它們的基因分化。結(jié)果表明ITS區(qū)域是保守的，不適于研究已經(jīng)存在于種之間的區(qū)別，而ISSR標(biāo)記可以用來進(jìn)行種內(nèi)種群研究。馮淑杰等人[32]研發(fā)了一套基于稻瘟病菌測序菌株70～15全基因族序列的121個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，利用這些標(biāo)記對無毒基因AvrPi7位點(diǎn)進(jìn)行了連鎖分析。Nguyen Anh Nghia等人[33]應(yīng)用形態(tài)學(xué)特征及ISSR標(biāo)記技術(shù)對從馬來西亞橡膠園中分離的21種橡膠棒孢霉葉斑病菌進(jìn)行了分類。

2.3 用于病原菌致病性研究

姜占發(fā)[34]應(yīng)用ISSR技術(shù)對我國主要棉區(qū)大麗輪枝菌進(jìn)行分子指紋分析，將供試的28株大麗輪枝菌分為SISG1、SISG2、SISG3、SISG4、SISG5、SISG6、SISG7共7個(gè)亞群，結(jié)果表明：每個(gè)亞群致病力與ISSR多態(tài)性表現(xiàn)出相關(guān)性；多態(tài)性、致病力與地理來源均未表現(xiàn)出相關(guān)性。馬鴻文等人[35]采用ISSR技術(shù)，研究了7個(gè)不同菌株的多態(tài)性、致病力分化和地理來源的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿褐斑病具有豐富的遺傳多樣性，不同地理來源的菌株有明顯的遺傳分化現(xiàn)象，菌株的致病力差異與ISSR遺傳聚類組群的劃分有一定的相關(guān)性，但與地理來源沒有明顯的相關(guān)性。

2.4 遺傳多樣性研究等方面

MENG Xiangqi等人[36]采用AFLP和ISSR技術(shù)對從豆科植物中分離的46種大豆莖褐腐病菌進(jìn)行了基因多樣性探測，并證明ISSR技術(shù)對該種菌的探測比AFLP技術(shù)更加經(jīng)濟(jì)有效。張勇等人[37]l利用SSR技術(shù)對以望水白/安農(nóng)8455的一粒傳產(chǎn)生的重組自交系進(jìn)行對抗赤霉病QTLs的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：75個(gè)引物在兩親本間有高達(dá)32.47%的多態(tài)性，其中5個(gè)引物在兩個(gè)親本和抗、感病間均有相同的多態(tài)性。Regina S.Redman等人[38]使用SSR標(biāo)記等方法對生長于太平洋東北部奧林匹克半島的Cantharellus formosus的群體基因性狀進(jìn)行分析。Cyril Dutech等人[39]應(yīng)用SSR等分子手段對實(shí)驗(yàn)中所得的多態(tài)性是否是從真菌中所獲得，進(jìn)行了論證。杜青等人[40]利用SSR技術(shù)對抗疫霉根腐病的大豆品種(系)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明：抗疫霉根腐病大豆品種(系)間的遺傳差異較大，通過聚類分析將166個(gè)品種分為6類。姚國勝等人[41]利用Pi4B和Pi4G兩個(gè)引物對來自河北和黑龍江省的58個(gè)馬鈴薯晚疫病菌株基因組DNA進(jìn)行了SSR基因型鑒定，分析了其遺傳多樣性。該研究完善了晚疫病菌研究的分子標(biāo)記體系。賈少鋒等人[42]建立了小麥白粉病的ISSR擴(kuò)增體系，明確了各引物的退火溫度，篩選出一些多態(tài)性較好的ISSR引物，并對小麥白粉病的遺傳多樣性和菌株毒性的關(guān)系進(jìn)行了比較和分析。何瑞等人[43]確立了鐮刀菌的ISSR-PCR的最適反應(yīng)條件，對27株鐮刀菌進(jìn)行ISSR的遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果表明，供試的27株鐮刀菌可分為3大類，兩個(gè)亞類，并對它們的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析。王子迎等[44]采用ISSR技術(shù)對來自中國黑龍江省、福建省和美國的3個(gè)大豆疫霉地理群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，研究了中國和美國大豆疫霉的遺傳關(guān)系。

3 結(jié)束語

SSR和ISSR標(biāo)記發(fā)展至今，已經(jīng)是十分成熟的標(biāo)記技術(shù)。實(shí)踐證明，它們可以被應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域中，是可靠高效的標(biāo)記技術(shù)。尤其是ISSR技術(shù)無需預(yù)先克隆和測序，而且多態(tài)性較高，信息量大，是一種應(yīng)用前景廣泛的DNA標(biāo)記技術(shù)。今后，可擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，例如將其應(yīng)用在動植物遺傳育種領(lǐng)域，生藥研究開發(fā)領(lǐng)域；就分析標(biāo)記本身，其發(fā)展也是無止境的，可以朝著多引物，通用引物方向發(fā)展，在加強(qiáng)經(jīng)典DNA標(biāo)記技術(shù)的完善與改進(jìn)，另一方面加快新型DNA標(biāo)記的開發(fā)，使分子標(biāo)記技術(shù)向著簡便，快速，準(zhǔn)確的方向發(fā)展。

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Application of SSR and ISSR Techniques in the Study of Plant Pathogenic Fungi

WANG Min

(Poplar Institute of Liaoning Province,Gaizhou 115200,China)

In this paper a description is given of the principle of SSR and ISSR technology,and the application of these two technologies is summarized in researches on plant pathogenic fungi from the identification of plant disease resistant gene,pathogenic fungi population genetic and small-kind physiological identification,pathogen pathogenicity research and genetic diversity.

SSR,ISSR,Plant pathogenic fungi

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.01.010

2016-11-25

國家林業(yè)局“948”項(xiàng)目(2014-4-02)。

王敏(1974-)，女，遼寧蓋州人，本科，高級工程師,從事林業(yè)技術(shù)工作。

S763.15

A

1003-5508(2017)01-0046-05