彭麒朕 耿建國(guó) 鄒大威 高彥彬 龔慕辛 吳曉明 尚雅文

·論著·

糖腎寧對(duì)高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞TGF-β1和P38MAPK表達(dá)的影響

彭麒朕 耿建國(guó) 鄒大威 高彥彬 龔慕辛 吳曉明 尚雅文

目的 觀察糖腎寧對(duì)高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinases，P38MAPK)表達(dá)的影響。方法 以體外高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、高糖培養(yǎng)組、高糖+纈沙坦組和高糖+糖腎寧高、中、低劑量組，使用大鼠含藥血清給藥分別處理24小時(shí)，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的含量水平；運(yùn)用Western Blot方法檢測(cè)P-P38MAPK、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、TGF-β1的蛋白水平。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)組系膜細(xì)胞上清液中FN蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與高糖組比較，糖腎寧組能明顯抑制P38MAPK及其下游核轉(zhuǎn)錄因子CREB 的水平，下調(diào)TGF-β1和FN的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 糖腎寧能夠抑制細(xì)胞外基質(zhì)增生，可能與下調(diào)TGF-β1，抑制P38MAPK/CREB信號(hào)通路的激活，從而抑制FN等細(xì)胞外基質(zhì)的合成有關(guān)。

糖腎寧； 糖尿病腎??； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1； 纖維連接蛋白

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠腎小球系膜細(xì)胞(SV40 MES 13)，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(250±20)g，均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

糖腎寧(主要藥物配比：黃芪4份、金櫻子2份、川芎1份、大黃1份、葛根2份，由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥制劑室制備成浸膏粉)；纈沙坦膠囊(商品名：代文，規(guī)格：80 mg/粒，批號(hào)X1448，北京諾華制藥有限公司)。

1.4 主要試劑

Anti-p38 antibody [M138](abcam)，Anti-CREB antibody [E306](abcam)，Anti-p38(phospho T180+Y182) antibody [M139](abcam)，Anti-TGF beta 1 antibody(abcam)，(FN)ELISA Kit(Cusabio)，DMEM低糖(Gibco)，0.05%胰蛋白酶溶液/EDTA(Gibco)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛)，胎牛血清(Hyclone)。

根據(jù)前面調(diào)查，農(nóng)村戶籍的訂單定向醫(yī)學(xué)生具有比城鎮(zhèn)戶籍的訂單定向醫(yī)學(xué)生更害怕失敗的特點(diǎn)，學(xué)校應(yīng)該完善其課程體系，注意做好相關(guān)思想教育工作。

1.5 主要儀器

顯微攝像系統(tǒng)(Nikon Eclipse 80i，北京瑞馳恒業(yè)儀器科技有限公司),低溫生物離心機(jī)(SIGMA，3K15，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9245A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，電子天平(YP601N，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(MR-96A，深圳邁瑞)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERAcell240i，賽默飛世爾)。

1.6 制備含藥血清

選取SD大鼠20只，隨機(jī)分為2組，含藥血清組(15只)和空白對(duì)照組(5只)，大鼠給藥量按人和動(dòng)物體表面積折算：大鼠給藥量為人體等效劑量8倍，即61.2 g/(kg·d)進(jìn)行灌胃，空白對(duì)照組用生理鹽水，每天灌胃1次(2.25 mL/250 g)，連續(xù)灌胃7天。末次灌胃1小時(shí)后腹主動(dòng)脈取血，將采集的血液在室溫中靜置4小時(shí)，3000 rpm，離心15分鐘，收集血清，56°C水浴30分鐘進(jìn)行滅活，然后過(guò)濾除菌，分裝。

1.7 實(shí)驗(yàn)分組及藥物濃度篩選

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)低糖培養(yǎng)的4～8代SV40 MES 13小鼠腎小球系膜細(xì)胞，消化收集，接種于96孔板培養(yǎng)待細(xì)胞完全貼壁，棄上清，加入不含胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，同步化24小時(shí)后，吸掉培養(yǎng)上清，分組加入藥物血清。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(N組，用D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的低糖型DMEM培養(yǎng)液)；高糖培養(yǎng)組(H組，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)；高糖+糖腎寧組(用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液分別加61.2 g/(kg·d)、30.6 g/(kg·d)、7.65 g/(kg·d)三個(gè)劑量10%糖腎寧含藥血清，分別命名T組、MT組、LT組)；高糖+纈沙坦組(V組，30 mmol/L 葡萄糖+10 μmol/L纈沙坦)干預(yù)24小時(shí)，每組設(shè)5復(fù)孔。置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)后待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中FN，細(xì)胞按5×104/孔，接種于96孔板培養(yǎng)，分組同上，于24小時(shí)收集各組上清100 μL，按FN試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格步驟操作。

1.8 Western blot法檢測(cè)小鼠腎小球系膜細(xì)胞P-P38MAPK、TGF-β1、CREB的蛋白含量

SV40 MES 13小鼠腎小球系膜細(xì)胞以2.5×107/L的密度接種到60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)饑餓同步化后，吸掉培養(yǎng)上清，分組加入纈沙坦藥物、糖腎寧含藥血清，實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組(N組，用D-葡萄糖濃度為5.5 mmol/L的低糖型DMEM培養(yǎng)液)；高糖培養(yǎng)組(H組，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液)；糖腎寧組(T組，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液+61.2 g/(kg·d) 10%糖腎寧含藥血清)；纈沙坦組(V組，30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L纈沙坦)。干預(yù)24小時(shí)后終止培養(yǎng)，棄去瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，用PBS液沖洗2次，吸干，加入細(xì)胞裂解液(RIPA和PMSF混合液)80 μL，放于冰上用細(xì)胞刮刮取3分鐘，吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)和刮子上的液體至1.5 mL的EP管中，測(cè)定各組蛋白含量，用10%的SDS-PAGE電泳分離分離蛋白質(zhì)，每孔取40 μg總蛋白含量上樣，用電泳儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜，TBS-T洗膜三次，每次5分鐘，5%的脫脂奶粉封閉1小時(shí)，用TGF-β1一抗、磷酸化P38MAPK一抗、CREB一抗，4℃孵育過(guò)夜，隔日TBS-T洗膜三次，每次5分鐘，之后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1小時(shí)，TBS-T洗膜三次，每次5分鐘，洗膜后加化學(xué)發(fā)光劑暗室膠片曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 糖腎寧對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞上清液中FN表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，高糖組系膜細(xì)胞上清液中FN含量顯著增加(P<0.05)；與高糖組比較，糖腎寧高、中劑量組上清液中FN含量均顯著減少(P<0.05)，其中高劑量組FN減少最為顯著，低劑量組FN含量與高糖組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；高、中、低劑量組FN的含量進(jìn)行兩兩比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明糖腎寧對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞上清液中FN表達(dá)的影響呈現(xiàn)劑量依賴性。故選擇T組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。詳見表1。

表1 各組小鼠腎小球系膜細(xì)胞上清液中FN的表達(dá)情況

注： 與N組相比，aP<0.05；與H組相比，bP<0.05；與T組相比，cP<0.05；與MT組相比，dP<0.05。

2.2 糖腎寧對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞中TGF-β1、P-P38MAPK、CREB蛋白水平表達(dá)的影響

與N組相比較，H組TGF-β1蛋白水平表達(dá)均明顯均上調(diào)(P<0.05);與H組比較，T組、V組的TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)。與N組相比較，H組P-P38MAPK蛋白水平表達(dá)均明顯均上調(diào)(P<0.05);與H組比較，T組、V組P-P38MAPK蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)。與N組相比較，H組CREB蛋白水平表達(dá)均明顯均上調(diào)(P<0.05);與H組比較，T組、V組CREB蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)。詳見表2，圖1～3。

表2 各組細(xì)胞中TGF-β1、P-P38MAPK、CREB蛋白水平表達(dá)±s)

注： 與N組比較，aP<0.05；與H組比較，bP<0.05。

圖1 各組細(xì)胞中TGF-β1蛋白的表達(dá)條帶

圖2 各組細(xì)胞中P-P38MAPK蛋白的表達(dá)條帶

圖3 各組細(xì)胞中CREB蛋白的表達(dá)條帶

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重和最常見的并發(fā)癥，也是臨床慢性腎衰竭最主要的原發(fā)病[5]。中國(guó)是糖尿病大國(guó)，根據(jù)國(guó)際最新臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，中國(guó)成年人群的糖尿病總體發(fā)病率約為11.6%，糖尿病前期的發(fā)病率是50.1%[6]；估計(jì)中國(guó)約有1.139億糖尿病患者，4.934億糖尿病前期患者，其中約有30%的1型糖尿病和20%的2型糖尿病發(fā)展為DN[7]。DN的主要病理改變?yōu)槟I小球基底膜增厚、腎小球系膜細(xì)胞增殖細(xì)胞外基質(zhì)積聚擴(kuò)張導(dǎo)致腎小球硬化、纖維化[8]。其中P38MAPK通路在DN的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，高糖環(huán)境可直接激活P38MAPK的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，P38MAPK與TGF-β1互為作用，TGF-β1與P38MAPK通路的激活有關(guān)[10]，P38MAPK通路的激活可以調(diào)節(jié)TGF-β1的轉(zhuǎn)錄與合成，從而可以引起細(xì)胞外基質(zhì)積聚加重腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，另一方面TGF-β1也是該通路的上游因子,可以通過(guò)增強(qiáng)P38MAPK的活性而發(fā)揮其生物活性[11]；P38MAPK一旦被激活，可以活化CREB等轉(zhuǎn)錄因子[12]，從而調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)FN產(chǎn)生增多，最終導(dǎo)致DN。

中醫(yī)認(rèn)為DN多屬于“消渴”“水腫”“尿濁”“關(guān)格”等范疇，根據(jù)不同的病因病機(jī)采取相對(duì)應(yīng)的辨證施治，DN多由糖尿病發(fā)展而來(lái)，因而高彥彬教授將糖尿病腎病命名為“消渴病腎病”[13]，認(rèn)為DN的基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)。發(fā)病初，肝腎氣陰兩虛，腎絡(luò)瘀滯，發(fā)病中陰損及陽(yáng)，脾腎虛衰，腎絡(luò)瘀阻，發(fā)病晚期，腎絡(luò)瘀結(jié)，因此將絡(luò)病理論應(yīng)用于DN的中醫(yī)藥防治當(dāng)中，并創(chuàng)立中藥復(fù)方糖腎寧制劑，方中黃芪益氣扶正；金櫻子固精縮尿；大黃逐瘀清熱降濁；川芎活血化瘀通絡(luò)[14]。前期臨床研究證實(shí)糖腎寧對(duì)于前期及臨床期腎病治療總有效率為90.0%，在減少蛋白尿、改善腎功能方面具有重要作用[15]。糖腎寧臨床隨機(jī)雙盲對(duì)照前瞻性研究證實(shí)該藥可明顯降低DN患者尿白蛋白、保護(hù)腎功能，且實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)及毒副作用，總有效率為88.9%，明顯優(yōu)于洛汀新對(duì)照組[16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖環(huán)境能明顯促進(jìn)小鼠腎小球系膜細(xì)胞中TGF-β1和P-P38MAPK蛋白表達(dá)增加、P38MAPK信號(hào)下游轉(zhuǎn)錄因子CREB活性增強(qiáng)、細(xì)胞上清液中FN的表達(dá)水平顯著增加；糖腎寧能顯著降低系膜細(xì)胞中TGF-β1和P-P38MAPK蛋白表達(dá)的水平，以及減弱P38MAPK信號(hào)下游轉(zhuǎn)錄因子CREB活性，細(xì)胞上清液中FN的表達(dá)水平顯著降低，尤以高劑量組顯著。推測(cè)糖腎寧抑制細(xì)胞外基質(zhì)增生的作用機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平，抑制P38MAPK信號(hào)通路的激活，從而抑制FN等細(xì)胞外基質(zhì)的合成有關(guān)，其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯： 王馨瑤)

Effects ofTangshenningon TGF-β1 and P38MAPK signal pathway in mouse mesangial cells with high glucose condition

PengQizhen，GengJianguo，ZouDawei，etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,BeijingKeyLaboratoryofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch,Beijing100069,China

Correspondingauthor:GengJianguo，E-mail:gengdoctor@163.com

Objective To observe the influence ofTangshenningon the expression of TGF- beta 1 and P38MAPK in murine mesangial cells cultured with high glucose. Methods Murine mesangial cells was used as the research subjects and divided into six groups: normal control group, high glucose group, high glucose administered with valsartan group, high glucose administered with high dosage ofTangshenning, high glucose administered with medium dosage ofTangshenningand high glucose administered with low dosage ofTangshenninggroup. All research subjects were administered with respective medicine according to their groups for 24 hours, then high glucose stimulated cell changes were observed, the protein level of the culture supernatant was measured by ELISA. The protein level of P38MAPK, CREB and TGF-β1 were detected by western blot. Results Compared with the normal control group, the proliferation rate of murine mesangial cells cultured in high glucose group is significantly higher (P<0.05), the expression of FN protein in the supernatant is significantly increased (P<0.05). Compared with the high glucose group, the proliferation of murine mesangial cells from all the threeTangshenninggroups were significantly depressed(P<0.05), the level of P38MAPK and its downstream transcription factor CREB were significantly decreased (P<0.05) and the expressions of TGF-β1 and FN were significantly down regulated(P<0.05). There were no significant differences in the indexes of between valsartan group and the threeTangshenninggroups. ConclusionTangshenningcould down regulate the expression of TGF-β1 and FN protein by inhibiting the P38MAPK signaling pathway, thereby inhibiting FN protein and protecting renal function.

Tangshenning； Diabetic nephropathy； Transforming growth factor-β1； Fibronectin

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81302951)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB518602)

100069 北京，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學(xué)系[彭麒朕(碩士研究生)、耿建國(guó)、鄒大威、高彥彬、龔慕辛、吳曉明(博士研究生)、尚雅文(碩士研究生)]

彭麒朕(1989- )，2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病。E-mail：pqzhdwj@163.com

耿建國(guó)(1956- )，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病。E-mail：gengdoctor@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.003

2016-08-07)