李昕 李雁 劉麗杰 黃瑞音 王謙 孫慶巧 駱長永 萬茂婷 梁旭 吳元德 王欣

·論著·

益氣化瘀解毒方對急性呼吸窘迫綜合征大鼠NF-κB/p38MAPK通路的影響

李昕 李雁 劉麗杰 黃瑞音 王謙 孫慶巧 駱長永 萬茂婷 梁旭 吳元德 王欣

目的 觀察益氣化瘀解毒方對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所致大鼠急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的保護作用并探討其作用機制。方法 30只SD大鼠隨機分為空白組、模型組及益氣化瘀解毒方低、中、高劑量組5組，每組6只。尾靜脈注射LPS建立ARDS模型。治療組益氣化瘀解毒方灌胃，造模后16小時處死大鼠收集標本，測定大鼠肺系數(shù)、肺通透指數(shù)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p50、IκBα、p38的蛋白表達及光鏡下觀察肺組織病理學改變。結(jié)果 益氣化瘀解毒方減少肺損傷大鼠肺泡結(jié)構破壞、肺水腫及炎性細胞浸潤，降低肺系數(shù)(P<0.05)與肺通透指數(shù)(P<0.01)，并在一定程度減少核轉(zhuǎn)錄因子-κB p50、絲裂原活化蛋白激酶p38，增加抑制因子IκBα的蛋白表達。結(jié)論 益氣化瘀解毒方對LPS誘導的ARDS有一定的保護作用，其機制與抑制NF-κB/p38MAPK炎性反應信號通路有關。

益氣化瘀解毒方； 急性呼吸窘迫綜合征； 核轉(zhuǎn)錄因子-κB ； 絲裂原活化蛋白激酶p38

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是臨床常見的急危重癥，是感染、創(chuàng)傷等病因下出現(xiàn)的以進行性呼吸困難、頑固性低血氧癥和肺水腫為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1]。核轉(zhuǎn)錄子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、p38MAPK信號通路能控制、調(diào)控白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等多種炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與表達，對ARDS促炎/抗炎平衡有重要的調(diào)控作用。課題組前期實驗研究結(jié)果顯示，益氣化瘀解毒方對急性呼吸窘迫綜合征大鼠具有良好的保護作用，其作用機制與減少促炎性介質(zhì)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α分泌，減輕炎癥水平有關，但其調(diào)節(jié)促炎/抗炎介質(zhì)平衡的作用機制尚未明確[2]。本研究通過觀察益氣化瘀解毒方對急性呼吸窘迫綜合征大鼠NF-κB/p38MAPK通路的影響，探討益氣化瘀解毒方調(diào)控ARDS炎性反應的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠30只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，許可證號SCXK(京)2012-0001，8周齡，體質(zhì)量(200±10) g。實驗期間飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部重點實驗室SPF級實驗動物房。

1.2 主要試劑、儀器

內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) Sigma，L2880)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，SDS、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)，PVDF Western轉(zhuǎn)印膜(Millipore)，兔抗大鼠NF-κB p50抗體、兔抗大鼠IκBα抗體、小鼠抗大鼠p38抗體(Abcam)，二抗(北京博奧森生物技術有限公司)，即用型免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(兔或鼠)(福建邁新生物技術開發(fā)有限公司)。益氣化瘀解毒方(黃芪30 g、三七10 g、赤芍15 g、炒枳實12 g、金銀花15 g、黃芩10 g、桑白皮15 g、葶藶子15 g)中藥顆粒由首創(chuàng)藥業(yè)提供。BH2生物顯微鏡(OLYMPUS)，Varioskan Flash光譜掃描多功能讀數(shù)儀(Thermo Scientific)。

1.3 動物分組與給藥

30只清潔級SD雄性大鼠隨機分為空白對照組、模型組、中藥低、中、高劑量組(簡稱低、中、高劑量組)，每組6只。適應性喂養(yǎng)1周后開始灌胃給藥，中藥低、中、高劑量組分別以6.1 g/(kg·d)、12.2 g/(kg·d)、24.4 g/(kg·d)(給藥劑量為生藥劑量)益氣化瘀解毒方溶液灌胃，空白組和模型組以1 mL/(100 g·d)劑量蒸餾水灌胃，每天1次，連續(xù)7天。

1.4 模型制備與標本采集

第7天灌胃后6小時，模型組及中藥低、中、高劑量組按照2 mg/kg劑量一次性尾靜脈注射LPS，造模后16小時腹腔注射10%水合氯醛溶液劑量(3 mL/kg)，開胸腔，經(jīng)左支氣管肺泡灌洗收集灌洗液，取右肺石蠟包埋成4 μm厚度的切片，HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學變化。

1.5 檢測指標

1.5.1 肺系數(shù)(lung coefficient, LI)和肺通透指數(shù)(lung permeability index, LPI) 大鼠開胸腔，取全肺及全部氣管，于5、6軟骨環(huán)間處將氣管剪斷，以潔凈濾紙吸干肺表面血污及組織液，稱全肺重量，計算LI[全肺濕質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)]。之后左右肺分離，右肺-80 ℃凍存，左肺，每次3 mL生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，反復灌洗3次，回收率50%以上，得BALF，3000 rpm離心10分鐘，取上清液分裝，-80℃凍存。Bradford法測定肺泡灌洗液蛋白含量和血漿蛋白含量，計算LPI(BALF蛋白含量/血漿蛋白含量)。

1.5.2 Western blot檢測NF-κB p50、IκBα、p38蛋白表達 提取肺組織總蛋白，4 ℃、12000 rpm離心10分鐘，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，120 v、80分鐘；轉(zhuǎn)膜用80v、60分鐘；5%的脫脂奶粉室溫封閉1小時。加入一抗稀釋液稀釋的一抗抗體(1∶1000)，孵育、洗滌，再加入相應二抗(1∶2000)，ECL化學發(fā)光檢測，于暗室中進行顯影。用成像分析系統(tǒng)Quantity One分析蛋白質(zhì)條帶。以吸光度值代表蛋白的強度，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的吸光度值的比值作為目的蛋白表達相對量。

1.5.3 免疫組化法檢測NF-κB p50、IκBα、p38在肺組織的表達 肺組織石蠟切片依次于二甲苯、100%、95%、90%、80%、70%乙醇中脫蠟、水化。PBS(PH值7.4)沖洗3分鐘×3次。浸入枸櫞酸溶液中，電磁爐加熱至95℃，加熱20分鐘進行抗原修復。PBS沖洗3分鐘×3次。過氧化物酶抑制劑室溫孵育10分鐘。PBS沖洗3分鐘×3次。血清封閉，去除血清滴加一抗，濕盒4℃孵育過夜。PBS沖洗5分鐘×3次。滴加二抗，PBS沖洗3分鐘×3次。滴加辣根過氧化物，PBS沖洗3分鐘×3次。滴加DAB，蒸餾水浸洗脫水透明封片。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織大體觀察

空白組大鼠肺組織未見明顯異常，色澤紅潤，體積未增大，無水腫，無瘀血；模型組大鼠肺組織體積增大，水腫明顯，色澤暗紅、表面可見散在分布大小不等的暗紅斑點狀病灶；各治療組大鼠肺組織體積較模型組縮小不明顯，水腫程度較輕，瘀血程度、出血點較模型組減輕。

2.2 各組大鼠肺組織病理學變化

空白組大鼠肺組織病理可見肺泡結(jié)構完整、清晰，肺泡腔內(nèi)及間隔無水腫；模型組肺泡欠清晰，肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚、肺泡腔縮小變形，伴炎性滲出及出血；各治療組肺泡結(jié)構呈不同程度破壞，肺泡腔內(nèi)炎性細胞浸潤，但程度均較模型組輕。見圖1。

2.3 肺系數(shù)及肺通透指數(shù)變化

與空白對照組比較，模型組肺系數(shù)值顯著升高，有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)；與模型組比較，中藥低劑量組肺系數(shù)值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥中、高劑量組肺系數(shù)也有一定程度降低，但差異無統(tǒng)計學意義；與模型組比較，空白組、中藥低劑量組、中劑量組及高劑量組肺通透指數(shù)值降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01)。

2.4 各組大鼠Western Blot檢測NF-κB p50、IκBα、p38蛋白表達

與模型組相比，中藥低劑量組NF-κB p50的表達相對下調(diào)，中藥中、高劑量組IκBα的表達相對上調(diào)，中藥低劑量組p38的表達相對下調(diào)。見圖2。

表1 各組大鼠肺系數(shù)與肺通透指數(shù)比較±s，n=6)

注： 與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01。

注：A空白組；B模型組；C中藥低劑量組； D中藥中劑量組；E中藥高劑量組

圖2 各組大鼠NF-κB p50、IκBα、P38的蛋白表達

2.5 各組大鼠免疫組化NF-κB p50、IκBα、p38表達

NF-κB p50：模型組陽性細胞廣泛表達在氣道黏膜上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、浸潤的中性粒細胞和巨噬細胞等細胞中，在胞漿和或細胞核內(nèi)均有較明顯表達，空白組可見肺泡上皮細胞陽性表達，染色程度低，其余細胞表達不明顯，各中藥治療組陽性細胞主要表達在氣道上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、浸潤的炎性細胞中，在巨噬細胞及內(nèi)皮細胞的胞漿、胞核內(nèi)表達較明顯，但染色程度低于模型組。見圖3～5。

IκBα：正常組陽性細胞主要表達在氣道上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞的胞漿中，空白組陽性表達、染色程度較模型組高，各中藥治療組陽性細胞表達在上皮細胞、內(nèi)皮細胞的胞漿中，相對于模型組表達均有升高。

注：A空白組；B模型組；C中藥低劑量組；D中藥中劑量組；E中藥高劑量組

圖1 各組大鼠肺組織病理觀察(標尺100 μm,HE×20)

注：A空白組；B模型組；C中藥低劑量組；D中藥中劑量組；E中藥高劑量組

圖3 各組大鼠NF-κB p50的蛋白表達(標尺100 μm)

注：A空白組；B模型組；C中藥低劑量組；D中藥中劑量組；E中藥高劑量組

圖4 各組大鼠IκBα的蛋白表達(標尺100 μm)

注：A空白組；B模型組；C中藥低劑量組；D中藥中劑量組；E中藥高劑量組

圖5 各組大鼠P38的蛋白表達(標尺100 μm)

p38：模型組陽性細胞廣泛表達于氣道上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞、浸潤的炎性細胞等細胞中，且胞質(zhì)與胞漿內(nèi)均有明顯陽性表達，各中藥治療組陽性細胞分布部位與模型組相似，但胞核陽性細胞表達明顯減少，信號較模型組有所減弱。

3 討論

ARDS是一種臨床常見的呼吸系統(tǒng)急危重癥，死亡率高，病理過程以肺微血管通透性增加，引發(fā)彌漫性肺間質(zhì)和肺泡腔水腫及炎性細胞浸潤為主。本研究模型組大鼠肺泡及肺間質(zhì)水腫，大量炎性細胞浸潤，肺泡腔縮小變形，并可見大量分泌物，內(nèi)含紅細胞；而益氣化瘀解毒方各治療組損傷程度均有不同程度的減輕，其中以中劑量組效果最為明顯，表明采用LPS尾靜脈注射方法復制大鼠ARDS模型成功，益氣化瘀解毒方對其有保護作用，且中劑量組作用最明顯。在肺系數(shù)體現(xiàn)大鼠肺水腫方面，中藥中、高劑量組變化不大，低劑量組較模型組有明顯變化；在肺泡通透性指標方面，中藥低、中、高劑量組較模型組均有明顯改善，且中藥高劑量組肺通透指數(shù)值最低，提示益氣化瘀解毒方對ARDS有較明顯的防治作用，并與藥物劑量存在一定的聯(lián)系。

NF-κB是內(nèi)皮激活過程中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，激活的NF-κB能調(diào)控多種炎性因子的表達，是ARDS炎性反應的樞紐和關鍵，抑制NF-κB的活化可以減少炎性因子的分泌。NF-κB通常是指在NF-κB/Rel家族成員中具有主要生物活性的p50/p65異源二聚體，p50由p105水解而成，含核定位信號，是核因子與DNA結(jié)合的部分。激活過程中NF-κB與抑制蛋白IκB發(fā)生磷酸化并解離，游離的NF-κB亞基移入核內(nèi)與目的基因的κB位點結(jié)合，從而介導炎癥反應主要功能蛋白的表達[3]。本研究顯示，模型組NF-κB p50蛋白表達較空白組增加，提示LPS可促進NF-κB p50蛋白表達，低、中、高劑量組NF-κB表達量較模型組下降，IκB表達量較模型組升高，提示益氣化瘀解毒方能在一定程度上抑制LPS誘導的NF-κB激活，同時上調(diào)IκBα表達與生成，從而限制NF-κB的激活和轉(zhuǎn)位、阻斷下游炎癥因子基因表達，保護ARDS。

絲裂原活化蛋白激酶信號通路在炎癥和氧化應激的細胞內(nèi)信號傳導中發(fā)揮重要作用，包括p38MAPK等多條信號通路。p38MAPK途徑被激活后，作用于自身底物，影響轉(zhuǎn)錄因子的活性，調(diào)控多種細胞因子的表達，從而調(diào)控炎癥反應[4]。本研究顯示，中藥低劑量組p38表達量較模型組下降較多，中、高劑量組作用依次增強，提示益氣化瘀解毒方能在一定程度上抑制LPS誘導的p38MAPK通路激活，減輕肺組織損傷，并且作用與中藥劑量相關。

肺氣虛衰、毒瘀互阻是急性呼吸窘迫綜合征的病機關鍵，益氣化瘀解毒為防治急性呼吸窘迫綜合征的重要治法。本課題組采用黃芪、三七、赤芍、炒枳實、金銀花等中藥組成“益氣化瘀解毒方”，具有益氣養(yǎng)血、活血化瘀、清熱解毒的功效，祛邪扶正并行，在一定程度上可以降低急性呼吸窘迫綜合征大鼠炎性相關因子水平。研究結(jié)果表明益氣化瘀解毒方可在一定程度上抑制急性呼吸窘迫綜合征大鼠NF-κB/p38MAPK炎性信號通路中的關鍵點蛋白表達，對LPS誘導的大鼠ARDS有一定的保護作用。

[1] 秦麗,王毓國,李敏,等.益氣活血中藥對脂多糖致急性肺損傷大鼠的防治作用[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2016,9(5):548-552.

[2] 李雁,王雙,李昕,等.益氣化瘀解毒復方聯(lián)合超低頻電磁場處理水對內(nèi)毒素誘發(fā)大鼠急性肺損傷的影響[J].中醫(yī)雜志,2015,57(9):783-788.

[3] Abraham E. NF-κB activation[J]. Crit Care Med, 2002,28(4Suppl):100-104.

[4] Moreira-Tabaka H, Peluso J, Vonesch J L, et al. Unlike for human monocytes after LPS activation，release of TNF-α by THP-1 cells is produced by a TACE catalytically different from constitutive TACE[J]. PloS One,2012,7(3):e34184.

(本文編輯： 王馨瑤)

Impact ofYiqiHuayuJieduformula on NF-κB/p38MAPK signal pathway in acute respiratory distress syndrome rats

LIXin,LIYan,LIULijie,etal.

DongzhimenHospital,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China

Correspondingauthor:LIYan,E-mail:liyan9921_@126.com

Objective To observe the impact and mechanism ofYiqihuayujieduformula on acute respiratory distress syndrome(ARDS) rats induced by endotoxin. Methods 30 SD rats were randomized control group, model group, YHJ high, middle, low dose group, 6 rats in each group. The ARDS model was established by tail vein injection with lipopolysaccharide. The treatment groups were given corresponding aqueous solution once a day. All groups were sacrificed 16 hours after modeling. Then the lung coefficient, the lung permeability index and the levels of NF-κB p50, IκBα and p38 were measured, and the pathological changes in lung tissues were observed. Results HE staining showed thatYiqihuayujieduformula could reduce pulmonary alveolar damage, pulmonary edema and inflammatory cells infiltration. The lung coefficient(P<0.05) and lung permeability index(P<0.01) were decreased in treatment groups. The protein expressions of NF-κB p50 and p38 were decreased while IκBα was increased in treatment groups. ConclusionYiqihuayujieduformula had prevention effect on endotoxin induced ARDS. It might relate to the inhibition of NF-κB/p38MAPK inflammatory signal pathway.

Yiqihuayujiedu formula； Acute respiratory distress syndrome； NF-κB； p38MAPK

北京中醫(yī)藥大學2015年度校級自主課題(2015-JYB-JSMS059)

100700 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院教育處(李昕)，急診科[李雁、劉麗杰、孫慶巧(碩士研究生)、駱長永(碩士研究生)、萬茂婷(碩士研究生)、梁旭(碩士研究生)]；北京市朝陽區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)二科(黃瑞音)；北京中醫(yī)藥大學生命科學學院(王謙)；北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院(吳元德)；廣東駿豐頻譜股份有限公司(王欣)

李昕(1984- )，女，博士，助理研究員。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治呼吸系統(tǒng)疾病。E-mail：lxnnn@126.com

李雁(1967- )，女，碩士，主任醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治呼吸系統(tǒng)疾病。E-mail：liyan9921_@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.005

2016-09-17)