亓希武,徐道華,于 盱,房海靈,李維林,梁呈元

(江蘇省中國科學院 植物研究所,江蘇 南京 210014)

金銀花肌動蛋白基因LjActin的克隆及在花發(fā)育過程中的表達分析

亓希武,徐道華,于 盱,房海靈,李維林,梁呈元

(江蘇省中國科學院 植物研究所,江蘇 南京 210014)

本研究在藥用植物金銀花中克隆得到1條肌動蛋白(Actin)基因序列,命名為LjActin(GenBank登錄號:KY114518)。序列分析表明其全長1536 bp,其中編碼框1134 bp,編碼377個氨基酸殘基,理論分子量為41.7 kDa,理論等電點為5.31。序列比對結(jié)果表明金銀花的Actin和其它植物的Actin在序列上高度保守。進化分析結(jié)果表明金銀花的Actin與擬南芥的AtACT7和水稻的OsACT2聚為一支。RT-PCR結(jié)果顯示LjActin在金銀花5個不同發(fā)育時期的花中表達穩(wěn)定。

金銀花;肌動蛋白；基因;克隆;表達

肌動蛋白(Actin)最早在脊椎動物骨骼肌細胞中被發(fā)現(xiàn),是真核生物中普遍存在的一種蛋白質(zhì),具有重要的生物學功能。閻隆飛等首次證明了肌動蛋白在高等植物中的存在[1]。隨著分子生物學技術的發(fā)展,許多植物的肌動蛋白基因相繼被克隆,氨基酸序列的比對分析表明植物的肌動蛋白在長度和序列上高度保守,暗示其在植物生命過程中具有重要的功能[2]。已有研究表明,植物肌動蛋白參與植物細胞形狀控制、細胞質(zhì)流動、細胞器運動、頂端生長、有絲分裂、重力感應等諸多生命過程[3-6]。此外,作為一個管家基因,肌動蛋白在不同的組織和發(fā)育時期中表達穩(wěn)定,因而常被用作基因表達研究中的內(nèi)參基因[7]。

金銀花又稱忍冬(LonicerajaponicaThunb.),是忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物。金銀花是一種重要的藥用植物,臨床應用非常廣泛,據(jù)統(tǒng)計有超過500種中藥制劑含有金銀花成分[8]。金銀花富含多種活性成分,如綠原酸[9]、木犀草苷[10]、黃酮[11]、揮發(fā)油[12]等。現(xiàn)代生化和醫(yī)學研究表明金銀花具有重要的生物學活性,包括抗氧化、抗炎癥、抗病毒、抗癌等[13]。長期以來,對金銀花的研究主要集中于活性成分的分離鑒定和活性分析。近年來,其分子生物學研究也逐步開展,尤其是活性成分生物合成相關基因的研究[14-17]。但是,金銀花肌動蛋白基因至今鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

供試金銀花品種為“四季樹型”,保存于江蘇省中國科學院植物研究所種質(zhì)資源圃。根據(jù)花的發(fā)育程度將其分為5個時期,分別是:幼蕾期(綠色花蕾,長度小于1.5 cm);綠蕾期(綠色花蕾,長度為2～3 cm);白蕾期(白色花蕾,長度為3.5～4.5 cm);銀花期(白色花,長度為5.0 cm左右)和金花期(黃色花,長度為5.0 cm左右)。花采摘后進行液氮速凍,之后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒為通用植物總RNA提取試劑盒,購自北京百泰克生物技術有限公司。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購自Promega公司。DNA聚合酶Ex-taq和pMD19-T simple載體購自TaKaRa公司。大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans-T1購自北京全式金生物技術有限公司。引物合成和測序由南京思普金生物科技有限公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 金銀花不同時期花的RNA提取及cDNA第1鏈的合成

將不同時期的金銀花材料置于研缽中,用液氮充分研磨至粉狀,參照通用植物總RNA提取試劑盒說明書提取各樣品的RNA。在進行質(zhì)量檢測后,取3 μg嚴格定量的總RNA,參照M-MLV使用說明,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

1.3 金銀花Actin基因的克隆及序列特征分析

根據(jù)金銀花轉(zhuǎn)錄組測序中分析得到的候選Actin基因序列,使用Primer Premier 5軟件設計引物,上游引物為:5’-AACCCTCCATCTACCTCAT-3’,下游引物為:5’- GCCATAGTAAGTCCGCATC-3’。以金銀花不同時期花的混合cDNA為模板進行PCR擴增,PCR反應體系為:10×PCR buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl24 μL、20 mmol/L dNTP 4 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL、cDNA模板2 μL、Ex-taq 0.4 μL,用去離子水補充至50 μL。PCR反應程序為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸90 s,共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下用刀片切取含有目的條帶的膠條,使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0進行DNA回收。將回收產(chǎn)物與pMD19-T simple載體進行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞,涂布含有氨芐抗性的LB平板中。將篩選得到的陽性克隆進行測序驗證。

將測序驗證的基因序列進行序列特征分析,其中編碼區(qū)預測和氨基酸翻譯用BioEdit完成;理論分子量和等電點預測在ExPASy(http://www.expasy.org/)網(wǎng)站上進行;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預測在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)網(wǎng)站上進行。

1.4 金銀花Actin基因的多重序列比對和進化分析

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載其它植物的Actin的序列,與金銀花的Actin一起進行多重序列比對,比對使用ClustalX軟件進行,使用GeneDoc軟件對比對結(jié)果進行編輯。使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,建樹方法選擇臨近結(jié)合法(Neighbor-Joining, NJ),自舉檢驗值設置為1000。

1.5 金銀花Actin基因在不同發(fā)育時期花中的表達分析

根據(jù)已克隆得到的金銀花Actin基因序列設計檢測其表達水平的特異性引物,上游引物為:5’- TGCCAATCTATGAAGGGTATG-3’,下游引物為:5’- AAGCACTTCCTGTGGACGAT-3’；以金銀花5個不同發(fā)育時期的花的cDNA為模板,進行PCR擴增。PCR反應體系為:10×PCR buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、20 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、cDNA模板1 μL、Ex-taq 0.2 μL,用去離子水補充至25 μL。PCR反應程序為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。對PCR擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花Actin基因的克隆及序列分析

根據(jù)金銀花轉(zhuǎn)錄組測序中分析得到的候選Actin基因序列設計引物,以不同發(fā)育時期的花的混合cDNA為模板進行PCR擴增,得到1條大小約為1.5 kb的條帶(圖1)；克隆后進行測序,驗證其為所要克隆的目的基因,將其命名為LjActin,并將序列提交GenBank(登錄號:KY114518)。序列分析表明該基因全長1536 bp,其中5’-UTR為183 bp,3’-UTR為219 bp,編碼框為1134 bp,編碼377個氨基酸殘基(圖2)。ExPASy在線預測表明該基因所編碼的蛋白質(zhì)的理論分子量為41.7 kDa,理論等電點為5.31。將該基因所編碼的氨基酸序列在SMART網(wǎng)站上進行結(jié)構(gòu)域預測，表明其具有典型的ACTIN結(jié)構(gòu)域。在NCBI中進行BLAST比對，顯示金銀花Actin與其它植物的Actin具有很高的序列相似性,如棗樹Actin-7(Ziziphusjujuba,100%)、可可Actin 7(Theobromacacao,100%)、黃瓜Actin-7(Cucumissativus,99%)、棉花Actin-7(Gossypiumraimondii,99%)、獼猴桃ACT1(Actinidiadeliciosa,99%)等。

2.2 金銀花Actin的多重序列比對和進化分析

將金銀花的Actin序列與其它植物[包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、煙草(Nicotianatabacum)、玉米(Zeamays)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、大豆(Glycinemax)、高粱(Sorghumbicolor)、胡蘿卜(Daucuscarota)和豌豆(Pisumsativum)]的Actin序列進行多序列比對,結(jié)果表明金銀花的Actin與其它植物的Actin在序列上高度保守(圖3)。將金銀花的Actin序列與雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻的Actin序列一起構(gòu)建進化樹,結(jié)果表明金銀花的Actin與擬南芥的AtACT7和水稻的OsACT2聚為一支(圖4)。此外,單、雙子葉植物的Actin在進化樹中相互交叉,表明被子植物的Actin基因家族起源于單、雙子葉植物分化之前的共同祖先。

圖1 金銀花Actin基因的PCR擴增結(jié)果

圖2 金銀花Actin基因及其編碼的氨基酸序列

2.3 金銀花Actin基因在不同發(fā)育時期花中的表達分析

根據(jù)克隆得到的金銀花Actin基因序列設計引物,以5個發(fā)育時期的花或花蕾的cDNA為模板進行RT-PCR,結(jié)果表明該基因在金銀花5個發(fā)育時期的花或花蕾中表達穩(wěn)定(圖5),因此可作為基因表達研究中的內(nèi)參基因。

3 討論

肌動蛋白是真核生物中普遍存在的一類古老的蛋白質(zhì),參與許多重要的生命活動。研究表明肌動蛋白基因在核苷酸水平和氨基酸水平上都具有高度的保守性[2]。本研究從藥用植物金銀花中克隆得到1個肌動蛋白基因,序列分析表明其全長1536 bp,其中編碼框1134 bp,編碼377個氨基酸殘基,所編碼的蛋白質(zhì)的理論分子量為41.7 kDa,理論等電點為5.31。序列比對表明金銀花的Actin和其它植物的Actin在序列上高度保守。

高等真核生物的肌動蛋白是由多基因家族所編碼的,高等植物中擬南芥中有10個肌動蛋白基因[18],水稻中有4個[19],豌豆中至少有18個[20]。本研究將金銀花的Actin序列與雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻的Actin序列一起構(gòu)建進化樹,結(jié)果表明金銀花的Actin與擬南芥的AtACT7和水稻的OsACT2聚為一支。研究表明擬南芥AtACT7基因?qū)χ参锛に?、光、損傷等有強烈反應[21],并且在愈傷組織形成、發(fā)芽和根的生長中都起到重要作用[22]。此外,進化分析顯示單、雙子葉植物的Actin在進化樹中相互交叉,表明被子植物的Actin基因家族起源于單、雙子葉植物分化之前的共同祖先[23]。

序列在SwissProt中的登錄號為:AtACT7(P53492)、OsACT1(Q10DV7)、NtActin(Q05214)、ZmACT1(P02582)、GhActin(O81221)、GmActin1(P02581)、SbActin1(P53504)、DcActin(P23343)、PsActin1(P30164)。

圖3 金銀花Actin與其它植物Actin的多序列比對結(jié)果

圖4 金銀花Actin與擬南芥、水稻Actin的進化分析結(jié)果

1:幼蕾期;2:綠蕾期;3:白蕾期:4:銀花期;5:金花期。

內(nèi)參基因是從分子生物學上研究基因表達水平的重要參考,主要是選擇表達穩(wěn)定的管家基因。植物中常用的內(nèi)參基因一般有肌動蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、微管蛋白基因(Tubulin)和18S rRNA等[24]。研究表明,不同的內(nèi)參基因只適用于一定的條件,并不存在所有情況下都穩(wěn)定表達的管家基因[25]。在本研究中,通過對金銀花不同發(fā)育時期的花的RNA嚴格定量,利用RT-PCR檢測了LjActin的表達水平,結(jié)果表明LjActin在5個發(fā)育時期的花中表達穩(wěn)定,可以作為金銀花的花發(fā)育過程中基因表達研究的內(nèi)參基因。

[1] 閻隆飛,石德權.高等植物中的收縮蛋白[J].生物化學與生物物理學報,1963(3):490-495.

[2] Hightower R C, Meagher R B. The molecular evolution of actin[J]. Genetics, 1986, 114(1): 315-332.

[3] Mathur J, Mathur N, Hülskamp M. Simultaneous visualization of peroxisomes and cytoskeletal elements reveals actin and not microtubule-based peroxisome motility in plants[J]. Plant Physiol, 2002, 128(3): 1031-1045.

[4] Barrero R A, Umeda M, Yamamura S, et al.ArabidopsisCAP regulates the actin cytoskeleton necessary for plant cell elongation and division[J]. Plant Cell, 2002, 14(1): 149-163.

[5] Franklintong V E. Signaling and the modulation of pollen tube growth[J]. Plant Cell, 1999, 11(11): 727-738.

[6] Palmieri M, Kiss J Z. Disruption of the F-actin cytoskeleton limits statolith movement inArabidopsishypocotyls[J]. J Exp Bot, 2005, 56(419): 2539-2550.

[7] Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, et al. Housekeeping genes as internal standards: use and limits[J]. J Biotechnol, 1999, 75(2-3): 291-295.

[8] Shang X, Pan H, Li M, et al.LonicerajaponicaThunb.: ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 138(1): 1-21.

[9] Lu H T, Jiang Y, Chen F. Application of preparative high-speed counter-current chromatography for separation of chlorogenic acid fromFloslonicerae[J]. J Chromatogr A, 2004, 1026(1): 185-190.

[10] Qiu F, Li Z, He L, et al. HPLC-ESI-MS/MS analysis and pharmacokinetics of luteoloside, a potential anticarcinogenic component isolated fromLonicerajaponica, in beagle dogs[J]. Biomed Chromatogr, 2013, 27(3): 311-317.

[11] Kumar N, Singh B, Bhandari P, et al. Biflavonoids fromLonicerajaponica[J]. Phytochemistry, 2005, 66(23): 2740-2744.

[12] Schlotzhauer W S, Pair S D, Horvat R J. Volatile constituents from the flowers of Japanese honeysuckle (Lonicerajaponica)[J]. J Agr Food Chem, 1996, 44(1): 206-209.

[13] Ku S K, Seo B I, Park J H, et al. Effect ofFlosloniceraeextracts on reflux esophagitis with antioxidant activity[J]. World J Gastroentero: WJG, 2009, 15(38): 4799.

[14] Yuan Y, Song L, Li M, et al. Genetic variation and metabolic pathway intricacy govern the active compound content and quality of the Chinese medicinal plantLonicerajaponicaThunb[J]. BMC Genomics, 2012, 13(1): 195.

[15] He L, Xu X, Li Y, et al. Transcriptome analysis of buds and leaves using 454 pyrosequencing to discover genes associated with the biosynthesis of active ingredients inLonicerajaponicaThunb[J]. PLoS ONE, 2013, 8(4): e62922.

[16] Yuan Y, Wang Z, Jiang C, et al. Exploiting genes and functional diversity of chlorogenic acid and luteolin biosyntheses inLonicerajaponicaand their substitutes[J]. Gene, 2014, 534(2): 408-416.

[17] Wu J, Wang X C, Liu Y, et al. Flavone synthases fromLonicerajaponicaandL.macranthoidesreveal differential flavone accumulation[J]. Sci Rep, 2016(6): 19245.

[18] Kandasamy M K, Mckinney E C, Meagher R B. Functional nonequivalency of actin isovariants inArabidopsis[J]. Mol Biol Cell, 2002, 13(1): 251-261.

[19] Reece K S, Mcelroy D, Wu R. Genomic nucleotide sequence of four rice (Oryzasativa) actin genes[J]. Plant Mol Biol, 1990, 14(4): 621-624.

[20] Cao X, Wang R, Yan L, et al. Construction of a pea tendril cDNA library and sequence analysis of a pea actin cDNA, PEAcl[J]. Chinese Sci Bull, 1994, 39(4): 332-337.

[21] Mcdowell J M, An Y Q, Huang S, et al. The arabidopsis ACT7 actin gene is expressed in rapidly developing tissues and responds to several external stimuli[J]. Plant Physiol, 1996, 111(3): 699-711.

[22] Gilliland L U, Pawloski L C, Kandasamy M K, et al.Arabidopsisactin gene ACT7 plays an essential role in germination and root growth[J]. Plant J, 2003, 33(2): 319-328.

[23] 李園莉,江元清,趙武玲,等.谷子肌動蛋白基因的克隆及序列分析[J].植物學報,2002,19(3):310-316.

[24] Stürzenbaum S R, Kille P. Control genes in quantitative molecular biological techniques: the variability of invariance[J]. Comp Biochem Phys B, 2001, 130(3): 281-289.

[25] Andersen C L, Jensen J L, ?rntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Res, 2004, 64(15): 5245-5250.

(責任編輯:黃榮華)

Cloning of Actin GeneLjActininLonicerajaponicaand Its Expression at Different Stages of Flower Development

QI Xi-wu, XU Dao-hua, YU Xu, FANG Hai-ling, LI Wei-lin, LIANG Cheng-yuan*

(Institute of Botany, Jiangsu Provincial and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China)

In this study, we cloned an actin geneLjActin(GenBank accession number: KY114518) from medicinal plantLonicerajaponicaThunb. The results of sequence analysis indicated that: the total length ofLjActinwas 1536 bp, and its ORF was 1134 bp encoding 377 amino acids; this actin gene possessed the theoretical molecular weight of 41.7 kDa and the theoretical isoelectric point of 5.31. Multiple sequence alignment showed that the sequence ofLjActininL.japonicawas highly conserved as that in other plants. Phylogenetic analysis showed that theLjActininL.japonicawas clustered into a clade with the AtACT7 inArabidopsisthalianaand the OsACT2 in rice (Oryzasativa). The result of RT-PCR indicated thatLjActincould steadily express in the flowers ofL.japonicaat 5 different developmental stages.

Lonicerajaponica; Actin; Gene; Cloning; Expression

2016-11-14

國家自然科學基金青年基金項目(31500249);江蘇省“六大人才高峰”資助項目(2015-NY-032);江蘇省中國科學院植 物研究所青年基金項目(SQ201401)。

亓希武(1986─),男,山東臨沂人,助理研究員,博士,從事藥用植物資源研究。

梁呈元。

Q943.2

A

1001-8581(2017)03-0090-05