尹慧敏 賈永林 李燕飛 段冉冉 景黎君 滕軍放 賈延劼△

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南開封市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 開封 475000

結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液外泌體中l(wèi)et-7d表達(dá)的研究

尹慧敏1)賈永林1，2﹚李燕飛1﹚段冉冉1﹚景黎君1﹚滕軍放1﹚賈延劼1﹚△

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南開封市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 開封 475000

目的 探討結(jié)核性腦膜炎(tuberculoulous meningitis，TBM)患者腦脊液外泌體的分離及外泌體中l(wèi)et-7d的表達(dá)水平及其意義。方法 收集我院15例結(jié)核性腦膜炎患者(結(jié)腦組，TBM組)，20例病毒性腦膜炎患者(病腦組，VM組)，10例化膿性腦膜炎患者(化腦組，PM組)及20例正常腦脊液患者(對(duì)照組)的腦脊液，采取ExoQuick Precipitation 提取法分離并純化外泌體，通過透射電鏡觀察其形態(tài)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測其let-7d表達(dá)水平。結(jié)果 (1)腦脊液中的外泌體，電鏡下呈圓形或茶托狀外形，直徑40～100 nm，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含有不同程度表達(dá)水平的let-7d；(2)結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液外泌體中l(wèi)et-7d的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(3)let-7d表達(dá)水平結(jié)腦組、化腦組與對(duì)照組相比均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病腦組與對(duì)照組相比也下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(4)let-7d表達(dá)水平在化腦組與結(jié)腦組相比明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(5)let-7d表達(dá)水平在結(jié)腦組與病腦組相比明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的腦脊液中可分離出外泌體，通過比較3種腦炎外泌體中l(wèi)et-7d的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在TBM患者中l(wèi)et-7d的表達(dá)水平顯著下調(diào)，為其診斷提供潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。

結(jié)核性腦膜炎；外泌體；分離；let-7d

結(jié)核性腦膜炎(TBM)是由結(jié)核分枝桿菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，約占神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病的70%。目前，診斷主要依靠腦脊液常規(guī)生化、細(xì)胞學(xué)檢查，然而在TBM發(fā)生的早期，腦脊液常規(guī)生化、細(xì)胞學(xué)變化多不典型[1]，因此，嚴(yán)重影響了TBM的早期診治，故探討TBM的潛在診斷標(biāo)志物具有重大的臨床意義。

外泌體(exosomes)是一種由細(xì)胞主動(dòng)分泌的大小均一、直徑40～100 nm的膜性囊泡小體，最早是由Pan等[2]從綿羊紅細(xì)胞上清液中分離的一種小囊泡，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，廣泛存在于血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中[3]。其內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等，在不同細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞，發(fā)生多種生物功能[4]。外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與正常的生理?xiàng)l件以及介導(dǎo)病理狀態(tài)[5]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病的發(fā)生、發(fā)展及損傷修復(fù)中起重要作用。

微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼的小分子單鏈RNA，長20～25個(gè)氨基酸。具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性，其主要功能是從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，廣泛參與多種生物的生命過程[6]。Let-7家族是miRNA重要的組成部分之一，包含13個(gè)成員，其中l(wèi)et-7d在大腦中的表達(dá)水平非常高，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起重要作用，可能成為某些疾病的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。本研究通過分離腦脊液中的外泌體，探討let-7d在外泌體中的表達(dá)水平及其意義。

1 資料和方法

1．1 臨床資料 選擇2015-01-2016-10就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的住院患者，其中15例結(jié)核性腦膜炎患者(結(jié)腦組)，男8例，女7例，年齡(31±17.53)歲；20例病毒性腦膜炎患者(病腦組)，男12例，女8例，年齡(35±4.85)歲；10例化膿性腦膜炎患者(化腦組)，男4例，女6例，年齡(40±8.95)歲；20例正常腦脊液患者(對(duì)照組)，男9例，女11例，年齡(38±10.51)歲。分別收集各組腦脊液標(biāo)本。該試驗(yàn)由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有受試者或其委托人知情同意。

1．2 入選標(biāo)準(zhǔn) (1)結(jié)腦組：有急性或亞急性腦膜炎的臨床表現(xiàn)，腦脊液檢測到結(jié)核分枝桿菌或合并肺結(jié)核，伴腦脊液檢測結(jié)果符合典型TBM的表現(xiàn)，Xpert MTB/RIF檢測陽性，腦脊液其他細(xì)菌、病毒、寄生蟲、腫瘤檢查均陰性，所有患者經(jīng)抗結(jié)核治療有效。(2)病腦組：有急性腦膜炎的臨床表現(xiàn)，血或腦脊液檢測到特異性病毒抗體，或經(jīng)PCR檢測到病毒DNA，或發(fā)病前1周內(nèi)有明確的病毒感染史，腦脊液其他細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤檢查均陰性，所有病例經(jīng)抗病毒治療有效。(3)化腦組：有急性腦膜炎的臨床表現(xiàn)，腦脊液培養(yǎng)中檢測到陽性致病菌，或腦脊液檢測結(jié)果符合典型PM的表現(xiàn)，腦脊液其他細(xì)菌、寄生蟲、病毒、腫瘤檢查均陰性，所有病例經(jīng)抗生素治療有效。(4)對(duì)照組：有頭痛的臨床表現(xiàn)，但神經(jīng)系統(tǒng)無陽性體征，腦脊液檢測結(jié)果正常。

1．3 方法

1．3．1 取材：用普通干燥管分別收取入組患者的腦脊液2 mL，于4 ℃，RCF(500)×g條件下離心10 min，以去除污染細(xì)胞，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 外泌體分離：取保存的結(jié)腦組、病腦組、化腦組、對(duì)照組的腦脊液，按照ExoQuick Precipitation(美國SBI公司)說明書分離提取CSF中的外泌體。

1．3．3 外泌體的形態(tài)學(xué)觀察：取分離純化的外泌體10 μL，滴加在2 mm的載樣銅網(wǎng)上，于室溫靜置1 min后用濾紙吸去多余液體，用2%(w/v)磷鎢酸鈉溶液10 μL滴加于載樣銅網(wǎng)上室溫復(fù)染5 min后用濾紙吸去多余液體，室溫晾干，于透射電子顯微鏡觀察并照相。

1．3．4 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)：按照 miRCURYTMRNA分離試劑盒(Exiqon公司)說明提取各組腦脊液外泌體中的RNA，分光光度法測定RNA含量及濃度。按照miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR system(Exiqon公司)說明書將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其反應(yīng)的總體積為20 μL。按照GoTaq?qPCR Master Mix熒光定量檢測試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量檢測，以U6為內(nèi)參，每例樣本重復(fù)檢測3次。應(yīng)用LightCycler 1.5定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測，計(jì)算每個(gè)處理組中的每個(gè)miRNA 的△Ct值，2-△△Ct表示目的基因miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2．1 外泌體的形態(tài)特征 通過透射電鏡觀察，各組均發(fā)現(xiàn)外泌體，其大小均一，直徑40 ～ 100 nm，呈圓形或茶托形的小囊泡，外周可見完整的膜性結(jié)構(gòu)，內(nèi)含低電子密度物質(zhì)(圖1)。

2．2 let-7d表達(dá)水平 實(shí)時(shí)定量PCR檢測在結(jié)腦組、病腦組、化腦組及對(duì)照組的let-7d的相對(duì)表達(dá)量(圖2)；結(jié)果顯示，let-7d表達(dá)水平結(jié)腦組、化腦組與對(duì)照組相比均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病腦組與對(duì)照組相比也下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；化腦組與結(jié)腦組相比明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)腦組組與病腦組相比明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 電鏡下可見TBM組外泌體直徑40～100 nm，呈圓形或茶托形的膜性小囊泡，其中心為低電子密度成分 圖2 采用qRT-PCR法檢測各組腦脊液外泌體中l(wèi)et-7d的表達(dá)水平

3 討論

外泌體作為細(xì)胞分泌的囊泡，近年來因其在細(xì)胞間的通訊作用受到人們的廣泛關(guān)注。這些囊泡通過轉(zhuǎn)運(yùn)分子(如miRNA)促進(jìn)細(xì)胞間的通訊，因此可用作指示疾病狀態(tài)的生物標(biāo)志物[7]。外泌體來源的miRNA已被用于癌癥的診斷與預(yù)后評(píng)估[8]。因此，通過從腦脊液中分離外泌體，并對(duì)其內(nèi)容物進(jìn)行檢測，具有重要的臨床意義。外泌體的提取方法包括超速離心、免疫磁珠、超濾、沉淀或試劑盒[9]。其中超速離心是最常用的分離方法，但其過程較費(fèi)時(shí)，回收率不穩(wěn)定，同時(shí)受限于儀器設(shè)備的配置；近年來，商品化的外泌體提取試劑盒受到廣泛應(yīng)用，操作簡便，不需特殊的儀器設(shè)備，同時(shí)可獲得高純度和高回收率的外泌體。本研究采用ExoQuick試劑盒分離提取腦脊液中的外泌體，透射電鏡下觀察到其為大小40 ～100nm，圓形或茶托形具有膜性的小囊泡，與國外文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。該方法同時(shí)極大縮短了外泌體的提取時(shí)間，簡化了操作步驟，因此可廣泛適用于外泌體的臨床研究。

TBM是臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，具有病死率高、致殘率高等特點(diǎn)，因此早期診斷及治療能夠顯著改善患者的預(yù)后[11]。但傳統(tǒng)的涂片抗酸染色鏡檢法敏感度低，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法所需時(shí)間較長，其當(dāng)前診斷主要依靠腦脊液常規(guī)生化、細(xì)胞學(xué)檢查，但早期腦脊液檢查結(jié)果常難于病毒性腦膜炎、化膿性腦膜炎等感染性疾病相鑒別，極易誤診。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，Wiwanitkit等[12]提出miRNA可能是結(jié)核感染中一個(gè)有用的生物標(biāo)志物，可能參與了其感染的發(fā)病機(jī)制。Yagi等[13]也認(rèn)為，腦脊液外泌體中miRNA可反映大腦的病理生理過程。本研究發(fā)現(xiàn)，在3種腦炎及正常人的腦脊液外泌體中均表達(dá)不同水平的let-7d，但與正常人相比化膿性腦膜炎外泌體中l(wèi)et-7d明顯下調(diào)，其下調(diào)幅度明顯大于TBM及病毒性腦膜炎，而TBM外泌體中l(wèi)et-7d與病毒性腦膜炎相比也明顯下調(diào)，因此，我們可通過檢測腦脊液外泌體中的let-7d水平區(qū)分這3種腦炎，為臨床診斷提供潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。

Let-7d作為let-7家族家族中的一員，存在于let-7a-1/let-7f-1/let-7d集群，位于人類基因組染色體9q22.3的B區(qū)[14]；作用于許多靶基因，如MYC、IMP-1、PPARγ受體等[14-16]。MYC是一種多功能、核內(nèi)磷酸化蛋白，其與Lin28相互作用，共同參與了細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡等過程[14]。同時(shí)，let-7家族也是RAS家族的直接和強(qiáng)有力的調(diào)控者，let-7d通過抑制K-RAS mRNA的表達(dá)引起細(xì)胞增殖的減少[17]。近年來，let-7家族被認(rèn)為在大腦的生長和形態(tài)形成中起重要的調(diào)節(jié)作用[18]，let-7d的表達(dá)水平與多能細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化中明顯相關(guān)[19]。研究認(rèn)為，miRNA被運(yùn)輸?shù)酵饷隗w，并使受體基因沉默，推測let-7d可能通過此方式調(diào)節(jié)結(jié)核性腦膜炎相關(guān)基因。

本研究表明，在結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液外泌體中l(wèi)et-7d表達(dá)明顯下調(diào)，可能為該病的診斷與鑒別提供新的生物學(xué)標(biāo)志物，但let-7d表達(dá)水平是否與結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生發(fā)展有更深的相關(guān)性，仍需進(jìn)一步深入研究。

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(收稿2016-11-12)

Study of the expression of let-7d from cerebrospinal fluid exosomes in patients with tuberculous meningitis

YinHuimin*，JiaYonglin，LiYanfei，DuanRanran，JingLijun，TengJunfang，JiaYanjie

*DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China

Objective To investigate the exosomes isolation from cerebrospinal fluid(CSF) in patients with tuberculous meningitis(TBM) and the expression of let-7d in exosomes．Methods The cerebrospinal fluid from 15 cases with tuberculous meningitis(TBM group)，20 cases with viral meningitis(VM group)，10 cases with purulent meningitis patients(PM group) and 20 normal cases(control group) was collected．ExoQuick Precipitation was used to isolate and purify exosomes and transmission electron microscopy was applied to observe the morphology．Eventually，the expression of let-7d was detected by real-time fluorescence quantitative PCR．Results (1)The exosomes in cerebrospinal fluid were round or cup-shaped，and the diameter was about 40～100nm．Real-time quantitative PCR found varying expression levels of let-7d in exosomes．(2)The expression level of let-7d in TBM group was significantly lower than that in control group(P<0.05)．(3)The TBM and PM groups showed higher down-regulation of the expression level of let-7d compared with the control group(P<0.05)．(4)The expression level of let-7d in the PM group was significantly down-regulated relative to the TBM group(P<0.05)．(5)Significant down-regulation of expression level of let-7d was found in TBM group compared with VM group(P<0.05)．Conclusion Exosomes can be isolated from cerebrospinal fluid in infectious diseases of the central nervous system．By comparing the expression level of let-7d in three sorts of encephslitis，we find that the expression of let-7d in TBM patients is significantly down-regulated，providing a potential biomarker for diagnosis．

Tuberculous meningitis；Exosomes；Isolation；Let-7d

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81371385)

R529.3

A

1673-5110(2017)06-0009-04

△通訊作者：賈延劼，E-mail：jiayanjie1971@aliyun.com