李蘭芝++吳坤鑫++張家明

摘要：以紫萍DW2501-4和HB0301產生的休眠體為材料，利用單因子試驗和正交試驗研究不同蔗糖含量、不同的GA3濃度、不同的溫度和光照條件誘導紫萍休眠體萌發(fā)的最適條件。結果表明，在1%～5%質量濃度蔗糖范圍內，高的蔗糖質量濃度會抑制休眠體的萌發(fā)，質量濃度為1%、2%的蔗糖對DW2501-4和 HB0301休眠體萌發(fā)誘導效果最好。在20～32 ℃，DW2501-4休眠體在32 ℃下萌發(fā)效果最佳，HB0301休眠體在28 ℃下萌發(fā)效果最佳。在0～10 mg/L 范圍內GA3能促進DW2501-4和HB0301休眠體的萌發(fā)，最佳濃度為0.1 mg/L。DW2501-4和HB0301在光—暗周期為24 h—0 h和16 h—8 h下萌發(fā)勢最高，葉狀體數量最多。3種日照時間下萌發(fā)率差異不顯著，但長日照可縮短休眠體萌發(fā)時間，促進葉狀體繁殖。DW2501-4和HB0301-4休眠體的最佳萌發(fā)誘導條件是0.5倍 Hoaglands 培養(yǎng)基中添加1%蔗糖和0.1 mg/L的GA3，在28 ℃，光—暗周期為16 h—8 h的條件下培養(yǎng)。

關鍵詞：紫萍；休眠體；萌發(fā)；最佳條件

中圖分類號： Q945.1；S555+.901文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0532-05

收稿日期：2016-05-19

基金項目：國家國際科技合作專項（編號：2014DFA30680）。

作者簡介：李蘭芝（1990—），女，湖北廣水人，碩士研究生，研究方向為植物分子遺傳學，E-mail：317004873@qq.com；共同第一作者：吳坤鑫（1969—），男，福建永定人，博士，副研，研究方向作物遺傳育種，E-mail：wukunxin@itbb.org.cn。

通信作者：張家明，博士，研究員。研究方向為生物質能源。E-mail：jmzhang@vip.163.com。

紫萍（Spirodela polyrrhiza （L.） Schleid.）屬于浮萍科（Lemnaceae）紫萍屬（Spirodela）。自然界中，夏末生長季節(jié)結束時紫萍會產生休眠體（turion）[1]。紫萍產生的休眠體直徑大約為2 mm，呈橢圓形，灰褐色。上表面平滑，下表面微微凸出。新形成的休眠體會沉入水底進行冬眠，經歷一段時間的低溫冬眠后，春天隨著溫度上升，光照時間延長，細胞內碳水化合物的代謝發(fā)生變化，冬眠才會被打破，休眠體開始萌發(fā)[2-3]。休眠體萌發(fā)時會從2個分生側囊中長出新的營養(yǎng)生殖葉片[4]。通過消耗休眠體內積累的大量淀粉，新葉會快速生長[4]。寒冷處理對紫萍休眠體進行預催熟而更有利于休眠體的萌發(fā)，光照、充足的碳水化合物的供應是促進休眠體萌發(fā)的必要條件[5-7]。影響休眠體萌發(fā)的主要因子包括溫度、光照、營養(yǎng)條件、GA3等[7-10]。在實驗室內紫萍的種質資源也可利用休眠體進行保種，研究休眠體快速萌發(fā)的條件是實驗室紫萍保種研究的重要部分。本試驗通過研究不同蔗糖含量、不同的GA3濃度、不同的溫度和光照條件對紫萍休眠體萌發(fā)的影響，以期為在實驗室長期保存紫萍種質資源提供理論依據。

1材料和方法

1.1試驗材料

試驗材料選用本實驗室保存的采自海南的紫萍 DW2501-4和湖北的紫萍HB0301。試驗于2015年1—12月在中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所試驗基地溫室內進行。利用其無菌無藻的葉狀體，在含0.005 mg/L ABA的0.5倍缺氮的Hoaglands培養(yǎng)基，24 ℃，16 h—8 h光—暗周期條件下，誘導休眠體。將誘導出的休眠體放在4 ℃冰箱中黑暗處理7 d，再接種到固體培養(yǎng)基中進行萌發(fā)誘導。本試驗用含瓊脂8 g/L的0.5倍Hoaglands固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。

1.2試驗方法

1.2.1單因子誘導試驗

不同蔗糖含量誘導試驗中，0.5倍Hoaglands 固體培養(yǎng)基作為對照組，用添加1%、2%、3%、5%（質量濃度）蔗糖的0.5倍Hoaglands固體培養(yǎng)基進行萌發(fā)誘導，培養(yǎng)條件為28 ℃，24 h光照。溫度試驗中，溫度設置為20、24、28、32 ℃，添加1%蔗糖的0.5倍Hoaglands固體培養(yǎng)基中，24 h光照進行萌發(fā)誘導。光照試驗中，光—暗周期為8 h—16 h、16 h—8 h、24 h—0 h，添加1%蔗糖的0.5倍Hoaglands固體培養(yǎng)基中，28 ℃下進行萌發(fā)誘導。GA3誘導試驗中，在添加不同濃度的GA3（濃度設置為0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 mg/L）的含1%蔗糖的0.5倍Hoaglands固體培養(yǎng)基中進行誘導，培養(yǎng)條件為28 ℃，24 h光照。每個培養(yǎng)皿中接種20個休眠體，重復3次，置于光溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2正交試驗

進行4因素3水平的L9（34）正交試驗，各因素水平見表1。A因素是蔗糖質量濃度，設1%、2%、3% 3個水平，B因素是GA3，設0.01、0.10、1.00 mg/L 3個水平，C因素是溫度，設24、28、32 ℃ 3個水平，D因素是光—暗周期，設8 h—16 h、16 h—8 h、24 h—0 h 3個水平。

每個皿接種20個休眠體，重復3次。根長1 mm或者葉狀體直徑1 mm均視為萌發(fā)，每24 h觀察記錄休眠體萌發(fā)情況，記錄休眠體萌發(fā)情況和葉狀體生長狀態(tài)，得到休眠體萌發(fā)誘導最佳條件。

1.2.3萌發(fā)測定指標

萌發(fā)時滯，即萌發(fā)啟動時間，指從萌發(fā)誘導試驗開始到第1個休眠體開始萌發(fā)所需要的時間；萌發(fā)高峰：日萌發(fā)數達到最大時的天數；萌發(fā)持續(xù)時間，從休眠體開始萌發(fā)到最后1個休眠體萌發(fā)所需的總天數；萌發(fā)勢=日萌發(fā)數最大時的總數/休眠體總數×100%；萌發(fā)率=7 d時休眠體萌發(fā)總數/休眠體總數×100%；葉狀體數：7 d時葉狀體總數。

1.3數據統計與分析

采用Excel進行數據處理，用SPSS 19.0統計分析軟件進行數據的方差分析與差異顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1蔗糖含量對紫萍休眠體萌發(fā)的影響

蔗糖含量對DW2501-4休眠體萌發(fā)的影響：如表2所示，在蔗糖含量為0、1%、2%、3%條件下，DW2501-4休眠體在第2 d開始萌發(fā)；在蔗糖含量為5%條件下，休眠體在第3 d開始萌發(fā)。在蔗糖含量為0條件下，休眠體在第4 d萌發(fā)達到高峰期，在蔗糖含量1%、2%、3%、5%條件下，依次在第 2 d、第3 d、第5 d、第5 d休眠體萌發(fā)達到高峰期；在蔗糖含量為0、1%、2%條件下，休眠體萌發(fā)持續(xù)9 d，3%、5%條件下，休眠體萌發(fā)持續(xù)11 d；在蔗糖含量為1%、2%條件下，葉狀體數顯著高于3%、5%。說明在蔗糖含量為1%、2%條件下，能有效誘導DW2501-4休眠體萌發(fā)，3%和5%的蔗糖抑制DW2501-4休眠體萌發(fā)。

蔗糖含量對HB0301休眠體萌發(fā)的影響：如表3所示，在蔗糖含量為0、1%、2%、3%、5%條件下，HB0301休眠體均在在第2 d開始萌發(fā)并達到高峰期；在蔗糖含量為0、1%、2%、3%條件下，休眠體全部萌發(fā)持續(xù)4 d，5%條件下，休眠體萌發(fā)持續(xù)6 d；在蔗糖含量為1%條件下，萌發(fā)勢、葉狀體數均顯著高于其他組，在2%條件下葉狀體數顯著高于0、3%、5%條件下，而在5%蔗糖下萌發(fā)勢和葉狀體數則顯著低于不含蔗糖的。說明在蔗糖含量為1%、2%條件下，能有效誘導HB0301休眠體萌發(fā)；5%的蔗糖抑制HB0301休眠體萌發(fā)。

在1%～5%蔗糖含量范圍內，高的蔗糖含量會抑制休眠體的萌發(fā)；含量為1%、2%的蔗糖對DW2501-4和 HB0301休眠體萌發(fā)誘導效果最好；在2%～5%蔗糖下，HB0301休眠體萌發(fā)高峰期早于DW2501-4，且萌發(fā)率和萌發(fā)勢高于DW2501-4。

2.2溫度的對紫萍休眠體萌發(fā)的影響

溫度對DW2501-4休眠體萌發(fā)的影響：如表4所示，在20 ℃下，DW2501-4休眠體在7 d時開始萌發(fā)，在24 ℃下，休眠體在3 d時開始萌發(fā)，在28、32 ℃下，休眠體在2 d時開始萌發(fā)；在24、28、32 ℃下，休眠體依次在4、2、2 d達到休眠體[CM（25]萌發(fā)高峰期，在20[KG*3]℃下，萌發(fā)遲緩，誘導7[KG*3]d未出現高峰期；在24、28、32 ℃下，休眠體萌發(fā)持續(xù)時間依次為7、6、6 d；在32 ℃下萌發(fā)勢、葉狀體數均顯著高于其他組。由表5可見，在20 ℃下，HB0301休眠體在7 d時開始萌發(fā)，在24 ℃下，休眠體在3 d時開始萌發(fā)，在28、32 ℃下，休眠體在2 d時開始萌發(fā)；在24、28、32 ℃下，休眠體依次在4、2、2 d達到休眠體萌發(fā)高峰期，在20 ℃下，萌發(fā)遲緩，誘導7 d未出現高峰期；在24、28、32 ℃下，休眠體萌發(fā)持續(xù)依次為5、4、4 d；HB0301在28、32 ℃下葉狀體數均顯著高于20、24 ℃。

[FK（W+32mm][HT6H][WTHZ][JZ]表5溫度對HB0301休眠體萌發(fā)的影響[HTSS]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK6，WK7。3，WK13。2，WK7W]溫度（℃）萌發(fā)時滯（d）萌發(fā)高峰（d）萌發(fā)持續(xù)時間（d）萌發(fā)勢（%）萌發(fā)率（%）葉狀體數（片）

[BHDG1*2，WK6，WK7。3，WK13。2DW，WK7W]20715.0±2.0b7±2c

[BHDW]2434560.0±2.0b100.0±0.0a58±4b

[BH]2822470.0±3.4a100.0±0.0a96±6a

[BH]3222465.0±4.1b100.0±0.0a92±4a[BG）F]

在20～32 ℃，大體上隨著溫度升高，休眠體萌發(fā)加快，葉狀體繁殖增多；雖然24～32 ℃萌發(fā)率一樣，但是28、32 ℃的萌發(fā)時滯和萌發(fā)高峰都要比24 ℃快；DW2501-4休眠體在32 ℃下萌發(fā)效果最佳，HB0301休眠體在28 ℃下萌發(fā)效果最佳。在24、28 ℃下，HB0301比DW2501-4所需萌發(fā)持續(xù)時間短，萌發(fā)勢高。

2.3GA3濃度對紫萍休眠體萌發(fā)的影響

GA3濃度對DW2501-4休眠體萌發(fā)的影響見表6。在0.000～10.000 mg/L范圍內的幾個GA3試驗濃度下，DW2501-4休眠體均在2 d時開始萌發(fā)，并且在2 d時達到萌發(fā)高峰期；在GA3濃度為0.000 mg/L和0.001 mg/L時，休眠體萌發(fā)持續(xù)9 d，在GA3濃度為0.010 mg/L和0.100 mg/L時，休眠體萌發(fā)持續(xù)7 d，在GA3濃度為1.000 mg/L和 1000 mg/L 時，休眠體萌發(fā)持續(xù)4 d；在0.010～10.000 mg/L范圍內的幾個GA3試驗濃度下，萌發(fā)率和葉狀體數均顯著高于GA3濃度為0.000 mg/L時，說明這幾個GA3濃度均對休眠體萌發(fā)起誘導作用。其中在10.000 mg/L濃度下，雖然萌發(fā)率高但葉狀體分化幾天后玻璃化。在GA3濃度為 0.100 mg/L 和1.000 mg/L時DW2501-4休眠體萌發(fā)勢、萌發(fā)率高，葉狀體總數多，生長狀態(tài)最好。

GA3濃度對HB0301休眠體萌發(fā)的影響見表7。在0000～10.000 mg/L范圍內的幾個GA3試驗濃度下，HB0301休眠體均在2 d時開始萌發(fā)，并且在2 d時達到萌發(fā)高峰期；在GA3濃度為0.000、0.010、0.100、1.000 mg/L時，休眠體萌發(fā)持續(xù)3 d，在GA3濃度為10.000 mg/L時，休眠體萌發(fā)持續(xù)4 d，葉狀體生長受抑制且?guī)滋旌蟛ＡЩ贕A3濃度為0.001 mg/L時，休眠體萌發(fā)持續(xù)5 d；不同GA3濃度下，萌發(fā)率無差異，但GA3濃度為0.010 mg/L和0.100 mg/L時萌發(fā)勢、 葉狀體數均顯著高于 1.000 mg/L 和 10.000 mg/L時[CM（25]。說明HB0301在GA3濃度為 0.100 mg/L 時萌發(fā)誘導效果最佳。

與不添加GA3相比在0.001～10.000 mg/L范圍內GA3能促進DW2501-4和HB0301休眠體的萌發(fā)，在GA3濃度為 0.100 mg/L 時休眠體萌發(fā)率高，葉狀體數最多，萌發(fā)效果最佳。

2.4光照時間對紫萍休眠體萌發(fā)的影響

由表8可見，在28 ℃，光—暗周期為24 h—0 h、16 h—8 h、8 h—16 h 下，DW2501-4休眠體在2 d時開始萌發(fā)，且在2 d時達到休眠體萌發(fā)高峰期；光—暗周期為24 h—0 h時和16 h—8 h時休眠體萌發(fā)持續(xù)時間都是6 d，小于8 h—16 h的9 d，而在16 h—8 h時萌發(fā)勢最高，在24 h—0 h時產生的葉狀體數最多。從表9可知，在28 ℃，光—暗周期為24 h—0 h、16 h—8 h、8 h—16 h 下，HB0301休眠體在2 d時開始萌發(fā)，且在2 d時達到休眠體萌發(fā)高峰期；在光—暗周期為 24 h—0 h和16 h—8 h下休眠體萌發(fā)持續(xù)時間都是4 d，小于8 h—16 h的5 d，而在 24 h—0 h 和16 h—8 h下萌發(fā)勢和葉狀體繁殖數量都要比 8 h—16 h 下高?？傊?，在上述3個光—暗周期下DW2501-4和HB0301中休眠體萌發(fā)率沒有顯著差異，但長日照可縮短休眠體萌發(fā)持續(xù)時間，并促進葉狀體繁殖。

2.5正交試驗結果分析

由表10可知，在1～6號試驗條件下，誘導7 d DW2501-4休眠體的萌發(fā)率均為100%，但在2號和3號試驗條件下，萌發(fā)完全所需時間最少，3號試驗條件下萌發(fā)勢最高，2號試驗條件下葉狀體最多。從表11可知，在1～7號試驗條件下，誘導7 d HB0301-4休眠體的萌發(fā)率均為100%，但在2號試驗條件下，萌發(fā)完全所需時間少，萌發(fā)勢最高，葉狀體最多。

DW2501-4和HB0301-4休眠體的最佳誘導條件是，05倍Hoaglands固體培養(yǎng)基中添加1%蔗糖和0.100 mg/L的GA3，在28 ℃，光—暗周期為16 h—8 h的條件下培養(yǎng)。

3結論與討論

可能會抑制休眠體的分化萌發(fā)。DW2501-4在蔗糖質量濃度為1%條件下萌發(fā)勢最高，葉狀體數在2%蔗糖下產生最多，其次是1%蔗糖。HB0301[JP+1]在蔗糖質量濃度為1%條件下萌發(fā)勢最高，葉狀體數也最多，其次是2%蔗糖。在3%蔗糖和5%蔗糖下，DW2501-4休眠體萌發(fā)完全所需時間相對較長，萌發(fā)勢和萌發(fā)率相對較低。隨著培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗，蔗糖含量降低，對分化的抑制作用降低，剩余的蔗糖可以繼續(xù)為葉狀體的分化和生長供能。因此含2%蔗糖的培養(yǎng)基營養(yǎng)供給比含1%蔗糖的多，對于葉狀體的持續(xù)分化和生長繁殖更有利。

在0.001～1.000 mg/L范圍內，總體上隨著GA3濃度升高，DW2501-4休眠體分化萌發(fā)持續(xù)時間越短，在 10.000 mg/L 濃度下葉狀體數量較多，但葉狀體分化幾天后玻璃化。DW2501-4在GA3濃度為1.000 mg/L時休眠體萌發(fā)勢最高，但在0.100 mg/L濃度下葉狀體總數最多，生長狀態(tài)最好。HB0301在GA3濃度為0.100 mg/L時，萌發(fā)所需時間短，萌發(fā)勢和萌發(fā)率高、葉狀體數多。GA3在一定濃度范圍內對休眠體萌發(fā)有誘導作用，且有最佳誘導濃度，因此GA3是誘導休眠體萌發(fā)的有效因子。

在20～28 ℃，總體隨著溫度升高，DW2501-4 和HB0301休眠體萌發(fā)時滯逐步減少，葉狀體繁殖增多。休眠體的萌發(fā)率從20 ℃的低位快速提升到24 ℃的100.0%。20 ℃下休眠體也可以萌發(fā)，只是萌發(fā)遲緩，說明溫度條件對休眠體萌發(fā)起重要作用；32 ℃下，雖然休眠體的萌發(fā)率和葉狀體數量也多，但 28 ℃ 下葉狀體生長狀態(tài)更好。更低或者更高的溫度都不利于HB0301和DW2501-4休眠體的萌發(fā)和葉狀體生長。在24 ℃和28 ℃，HB0301休眠體比DW2501-4休眠體萌發(fā)持續(xù)時間短，萌發(fā)勢高，說明相同條件下HB0301休眠體比DW2501-4休眠體更易萌發(fā)。[JP+1]

DW2501-4 在光—暗周期為16 h—8 h下萌發(fā)勢最高，24 h—0 h [JP+1]時產生葉狀體數量最多；HB0301在光—暗周期為 24 h—0 h 下萌發(fā)勢最高，葉狀體數量最多；3個光—暗周期下萌發(fā)率沒有明顯差異，但長日照可縮短休眠體萌發(fā)時間。

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