韓曉磊 顧益 潘林煒 沙永良 徐建榮 韓曜平

摘要：基于AFLP分子標記技術(shù)對太湖流域中華鱉花鱉群體和普通群體進行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，用6對引物對2個群體52個中華鱉個體進行檢測，共獲得335個位點，其中多態(tài)位點88個，平均多態(tài)位點比例為 26.27%。普通群體和花鱉群體的Shannons指數(shù)分別為0.377 9、0.229 2，Neis指數(shù)分別為0.257 3、0.151 2，顯示2個群體遺傳多樣性處于同一水平；中華鱉花鱉群體和普通群體的種間遺傳相似度為0.948 3，遺傳距離為0.531；通過UPGMA法對2個群體進行聚類分析顯示，兩者基本能夠分別聚類，產(chǎn)生了一定的遺傳趨異；太湖流域2個群體中華鱉的遺傳多樣性相對貧乏，花鱉群體與普通群體產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化，可能分屬于不同的亞種群。

關(guān)鍵詞：中華鱉；AFLP；遺傳多樣性；遺傳分化

中圖分類號： Q959.6+3；S917文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0101-03

收稿日期：2016-07-16

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2013349）。

作者簡介：韓曉磊（1981—），男，河北邯鄲人，碩士，實驗師，主要從事淡水水生生物學研究。E-mail：hanxiaolei0724@163.com。

通信作者：韓曜平，博士，教授，主要從事水產(chǎn)品生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)研究與示范推廣。E-mail：975683768@qq.com。

擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術(shù)具有多態(tài)性豐富、顯性表達、無復等位效應(yīng)、靈敏度高、快速高效等優(yōu)點，可在較短時間內(nèi)掌握大量遺傳信息，已被廣泛應(yīng)用于水生動物遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及系統(tǒng)分類等方面[1-3]。中華鱉（Pelodiscus sinensis）隸屬于爬行綱（Reptilia）、龜鱉目（Testudoformes）、鱉科（Trionychidae），別稱甲魚、團魚、王八等。中華鱉在我國分布廣泛，除西藏、青海外的其他各?。ㄊ小^(qū)）均有發(fā)現(xiàn)，長江流域和華南地區(qū)分布較多[4-5]。太湖花鱉屬于中華鱉的地方特色品種，主要生活在長江中下游特別是太湖流域，因其背上有對稱的黑色小圓花點，在野生環(huán)境中身體油綠，裙邊寬厚，腹部有灰黑色塊狀花斑，故此得名。太湖花鱉野性十足，具有生長快、色澤艷、肉質(zhì)好等特點，并因其獨特的風味和較高的營養(yǎng)價值深受消費者喜愛。江浙地區(qū)廣泛養(yǎng)殖太湖花鱉，市場前景良好。研究顯示，中華鱉還沒有明確的亞種分類，但卻存在一些不同的地理群體，其中太湖花鱉的分類地位也沒有明確論斷[6]。本研究利用AFLP分子標記技術(shù)對太湖流域中華鱉花鱉群體和普通群體進行遺傳多樣性分析，判斷2個群體是否有遺傳分化，以期為太湖流域中華鱉不同群體間的種質(zhì)鑒定和分類地位提供理論支持。

1材料與方法

1.1材料

2個中華鱉群體樣品采集于2014年5—10月期間，其中花鱉群體采集于太湖流域的江蘇省太倉地區(qū)（簡稱T，野生群體，圖1），普通群體采集于太湖流域的江蘇省常州地區(qū)（簡稱C，野生群體，圖2）。以中華鱉腿部肌肉組織為材料，于無水乙醇中-20 ℃保存?zhèn)溆?，分別取30尾T群體、22尾C群體用于AFLP分析。

1.2DNA提取

中華鱉基因組DNA的提取參照韓曉磊等的方法[7]。用分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000）測定基因組DNA的濃度，并通過凝膠成相系統(tǒng)（UVP Biospectrum 410）檢測DNA的完整性，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3AFLP分析

參照韓曉磊等的方法[7]構(gòu)建AFLP圖譜，引物、人工接頭由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，選擇性擴增使用了3種EcoRⅠ引物、3種MseⅠ引物共9個引物組合，接頭序列、預擴增引物序列、選擇性引物序列見表1。根據(jù)預試驗結(jié)果，從擴增帶數(shù)目適中、多態(tài)性高的引物組合中選取了E38M51、E38M54、E42M51、E42M54、E44M48、E44M51等6組引物組合。擴增產(chǎn)物在4.5%聚丙烯酰胺凝膠上進行60 W恒功率高壓電泳，對電泳結(jié)果進行銀染檢測。

1.4數(shù)據(jù)分析

將電泳圖譜中同一位置上有無AFLP條帶情況進行統(tǒng)計，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，得出“0，1”原始數(shù)據(jù)矩陣。對AFLP數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計的遺傳學參數(shù)主要如下。

顯性基因型頻率Pd計算公式為：

[JZ（]Pd=ni/n；[JZ）][JY]（1）

式中：ni為位點i上有帶的個體數(shù)，n為總個體數(shù)。

多態(tài)位點比率P計算公式為：

[JZ（]P=多態(tài)位點數(shù)/位點總數(shù)×100%。[JZ）][JY]（2）

遺傳相似系數(shù)Sxy計算公式為：

[JZ（]Sxy=2Nxy/（Nx+Ny）；[JZ）][JY]（3）

式中：Nxy是個體x和個體y共有位點數(shù)；Nx、Ny分別是個體x和個體y總位點數(shù)。

遺傳距離D計算公式為：

[JZ（]D=1-S；[JZ）][JY]（4）

式中：S為相似系數(shù)。

利用POPGEN 32軟件計算遺傳相似度和遺傳距離等，利用MEGA 3.0軟件構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)樹。

2結(jié)果與分析

2.1AFLP擴增結(jié)果

由表2可見，經(jīng)篩選，用6對引物組合對T、C 2個中華鱉群體總計52個樣品DNA進行了AFLP擴增，選取100～2 000 bp 的清晰條帶，共計335條，以上片段中多態(tài)性條帶為88條，多態(tài)位點比例為26.27%。不同引物組合所擴增的位點數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)相差不大，擴增條帶數(shù)為50～59條，多態(tài)性條帶為12～16條，多態(tài)位點比例為24.00%～28.57%。其中在C、T 2個群體中分別擴增出76、75條擴增條帶，平均多態(tài)位點比例分別為22.69%、22.39%。圖3為引物E44M48在太湖流域中華鱉2個群體中的擴增圖譜。

2.22個中華鱉群體的遺傳多樣性和遺傳距離分析

由表3可見，中華鱉花鱉群體和普通群體的Shannons指數(shù)分別為0.377 9、0.229 2，Neis指數(shù)分別為0.257 3、0.151 2，可見花鱉群體的遺傳多樣性略低于普通群體，2個群體遺傳多樣性處于同一水平。花鱉群體、普通群體的種間遺傳相似度為0.948 3，遺傳距離為0.053 1。

2.3聚類分析

通過Popgen 32軟件用UPGMA方法構(gòu)建了52個太湖流域中華鱉個體的系統(tǒng)樹（圖4）。中華鱉普通群體、花鱉群體基本能夠分別聚類，出現(xiàn)了明顯的遺傳分化。

3結(jié)論與討論

3.1遺傳多樣性分析

本研究選用6對引物對太湖流域中華鱉花鱉群體和普通群體共計52個個體進行AFLP檢測，共獲得335個位點，其中多態(tài)位點88個，平均多態(tài)位點比例為26.27%，與已報道的其他水生動物AFLP數(shù)據(jù)[7-10]對比發(fā)現(xiàn)，太湖流域中華鱉群體的遺傳多樣性處于較低水平。通過分析Shannons指數(shù)、Neis指數(shù)，得出了同樣的結(jié)論。中華鱉花鱉群體、普通群體的平均多態(tài)位點比例、Shannons指數(shù)、Neis指數(shù)均無明顯差異，判定兩者遺傳多樣性處于同一水平。

自古以來中華鱉就是名貴的食物和藥材，近代中華鱉的人工養(yǎng)殖發(fā)展非常迅速[11]。隨之而來的是野生甲魚被捕獲用于食用與養(yǎng)殖，導致了自然種群混雜，群體多樣性不斷降低，中華鱉種質(zhì)嚴重退化，野外個體數(shù)量不斷減少[12]。日前世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）發(fā)布的最新版全球瀕危物種紅色名錄，已將中華鱉列入瀕危物種名單[13]?；谝陨锨闆r，必然導致中華鱉野外種群形成小群體，加速了繁殖群體的日益縮小，增加了近交頻率的發(fā)生，容易出現(xiàn)小群體效應(yīng)，最終造成2個中華鱉群體遺傳多樣性處于較低水平，這也從基因水平說明了其處于瀕危狀態(tài)的現(xiàn)狀，因此開展對中華鱉野生群體遺傳多樣性的保護工作勢在必行。

3.2群間遺傳分化分析

Thorp研究認為，種群間的遺傳距離為0.03～0.20（遺傳相似度是0.80～0.97）[14]。本研究中，中華鱉2個群體的遺傳距離為0.053 1，表明花鱉群體、普通群體之間的遺傳分化處于群間差異，還未達到種間水平。聚類分析表明，中華鱉2個群體分別聚類，已經(jīng)存在明顯歧化，揭示花鱉群體與普通群體已經(jīng)形成各自獨立的遺傳結(jié)構(gòu)，兩者產(chǎn)生了明顯的遺傳分化。太湖花鱉屬于中華鱉的地方特色品種，與中華鱉普通品種在形態(tài)上存在較大不同，本研究中兩者遺傳分化程度雖然還沒有達到種間水平，但已經(jīng)產(chǎn)生了明顯的遺傳趨異，可能分屬于不同的亞種群，這與研究關(guān)于不同群體中華鱉形態(tài)多樣性分析結(jié)果一致。當然，中華鱉花鱉群體與普通群體之間分類關(guān)系的確定，除了分子和形態(tài)方面的研究，還有賴于器官組織和細胞水平方面的研究予以論證。

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