黃穎+姚血明+唐芳+徐暉+王瑩++馬武開(kāi)

【摘 要】目的：研究艾拉莫德對(duì)牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型的抗炎作用。

方法：將40只6周齡Wistar雌性大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、甲氨蝶呤組、艾拉莫德組，每組10只。除空白對(duì)照組外，其余各組以Ⅱ型膠原和冰醋酸制備CIA模型?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤2.5 mg·kg-1，每周1次灌胃，艾拉莫德組給予艾拉莫德10 mg·kg-1·d-1灌胃。觀察各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、滑膜病理變化，ELISA法檢測(cè)艾拉莫德對(duì)大鼠血清白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的影響。結(jié)果：艾拉莫德可明顯改善CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理，可明顯減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹，下調(diào)血清IL-1、IL-1β、TNF-α水平，且艾拉莫德組優(yōu)于甲氨蝶呤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。結(jié)論：艾拉莫德對(duì)CIA模型鼠關(guān)節(jié)滑膜有保護(hù)及明顯的抗炎作用，其機(jī)制可能與下調(diào)致炎因子IL-1、IL-1β、TNF-α水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；艾拉莫德；關(guān)節(jié)滑膜病理；IL-1；IL-1β；TNF-α；大鼠

Anti-inflammatory Effect of Iguratimod on Collagen-induced Arthritis Rat Models

HUANG Ying，YAO Xue-ming，TANG Fang，XU Hui，WANG Ying，MA Wu-kai

【ABSTRACT】Objective：To study the anti-inflammatory effect of Iguratimod on bovine type Ⅱ collagen-induced arthritis rat models（CIA models）.Methods：Forty six-week female Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，a methotrexate group and an Iguratimod group，with ten rats in each.Except the blank control group，CIA models were established in the other groups with collagen typeⅡ and glacial acetic acid.The blank control group and the model control group were given intragastric administrations respectively with normal saline，the methotrexate group was given intragastric administrations with 2.5 mg·kg-1 of methotrexate，once a week，while the Iguratimod group was given intragastric administrations with 10 mg·kg-1 ·d-1

of Iguratimod，observing the swelling degree and the pathological changes of synovial membrane.ELISA method was used to detect the effects of Iguratimod on the levels of IL-1，IL-1β and TNF-α.Results：Iguratimod could significantly improve the pathology of synovial tissue in CIA rats，obviously reduce their joint swelling，and down regulate the levels of IL-1，IL-1β and TNF-α in them，the Iguratimod group being better than the methotrexate group and the difference being statistically significant（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：Iguratimod has protective and anti-inflammatory effects on CIA rat models，whose mechanism may be related to the down-regulation of inflammatory factors IL-1，IL-1β and TNF-α.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；collagen-induced arthritis；Iguratimod；synovial membrane pathology；

IL-1；IL-1β；TNF-α；rats

艾拉莫德（T-614）是一種新型的具有多作用靶點(diǎn)的抗風(fēng)濕藥物，在相關(guān)臨床觀察中具有良好的療效及耐受性[1]，治療RA主要的作用機(jī)制為抗炎、抑制免疫球蛋白合成、抑制細(xì)胞因子生成、抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成[2]。白細(xì)胞介素-1（IL-1）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是RA滑膜炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的細(xì)胞因子[3-4]。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，研究艾拉莫德對(duì)CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理及血清IL-1、IL-1β、

TNF-α水平的影響，探討該藥的抗炎作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡健康清潔級(jí)雌性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（170±15）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與設(shè)備 牛Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為C7806-2、F5881）；醋酸（上海國(guó)藥集團(tuán)試劑公司，生產(chǎn)批號(hào)T20100913）；大鼠IL-1、IL-1β、TNF-α ELISA試劑

盒（武漢華美生物工程公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為CSB-E04622r、CSB-E08055r、CSB-E11987r）；電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器公司，型號(hào)HW.SY11-KP2）。

1.3 藥 物 艾拉莫德片（先聲藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20110084）；甲氨蝶呤片（上海信誼藥廠有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020644）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組 將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、艾拉莫德組、甲氨蝶呤組，每組10只。

2.2 模型制備 空白對(duì)照組不做任何處理，其余各組大鼠按照參考文獻(xiàn)[5]將牛Ⅱ型膠原溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的冰醋酸中，按比例與弗氏完全佐劑1∶1充分混和乳化，于Wistar大鼠右后足跖肉墊內(nèi)注射0.4 mL，第7天以相同乳劑及劑量于大鼠尾根部加強(qiáng)注射。

2.3 給藥方法 從第2次免疫后開(kāi)始灌胃，艾拉莫德組大鼠給予艾拉莫德10 mg·kg-1·d-1；甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤2.5 mg·kg-1，每周1次；空白對(duì)照組、模型對(duì)照組均給予生理鹽水。共給藥4周。

2.4 關(guān)節(jié)腫脹率 用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠左后肢踝關(guān)節(jié)的直徑（mm），每周測(cè)1次。以第1天測(cè)得值為基值，以后的測(cè)得值與基值的比值即為關(guān)節(jié)腫脹率。

2.5 TNF-α、IL-1、IL-1β檢測(cè) 給藥4周后，大鼠股動(dòng)脈取血，離心取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作檢測(cè)。加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，

37 ℃反應(yīng)30 min，洗板5次；加入酶標(biāo)試劑，37 ℃

反應(yīng)30 min，洗板5次；加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min，加入終止液；最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)曲線方程式計(jì)算各樣本濃度值。

2.6 關(guān)節(jié)滑膜病理情況 麻醉處死大鼠取血后，取右后踝關(guān)節(jié)滑膜組織，EDTA脫鈣，常規(guī)梯度脫水、石蠟包埋、切片，HE染色。光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞和血管的增生、滑膜層及滑膜下層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等情況。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，符合正態(tài)分布滿足方差齊性，采用單因素分析；不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)（秩和）檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理表現(xiàn) 空白對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)滑膜未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生；模型對(duì)照組滑膜組織見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)內(nèi)纖維組織增生；甲氨蝶呤組滑膜組織見(jiàn)較多淋巴細(xì)胞、少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分滑膜腔和關(guān)節(jié)腔內(nèi)見(jiàn)炎性滲出物；艾拉莫德組近關(guān)節(jié)腔的滑膜結(jié)構(gòu)較正

常，其他組織內(nèi)可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

3.2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)腫脹率比較 治療前，各造模組關(guān)節(jié)腫脹率與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；造模7 d時(shí)，各模型對(duì)照組關(guān)節(jié)腫脹率開(kāi)始上升，14 d時(shí)達(dá)到高峰，模型對(duì)照組關(guān)節(jié)腫脹率與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；21～28 d時(shí)，艾拉莫德組、甲氨蝶呤組關(guān)節(jié)腫脹率明顯下降，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；艾拉莫德組與甲氨蝶呤組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

3.3 各組大鼠血清IL-1、IL-1β、TNF-α的表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1、IL-1β、TNF-α表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，艾拉莫德組、甲氨蝶呤組IL-1、IL-1β、TNF-α的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；艾拉莫德組優(yōu)于甲氨蝶呤組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。見(jiàn)表2。

4 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床最常見(jiàn)的風(fēng)濕免疫性疾病之一，發(fā)病率高，病情呈慢性過(guò)程，遷延反復(fù)，致殘率高，嚴(yán)重影響患者健康及生存質(zhì)量。本病基本病理為關(guān)節(jié)滑膜炎，活動(dòng)期關(guān)節(jié)滑膜充血、水腫、纖維素樣壞死，并伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[6]。CIA大鼠模型發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、病理以及免疫學(xué)特征均與RA最為相近[7]，

故被廣泛用于RA發(fā)病及治療機(jī)制的研究。

在RA滑膜炎的啟動(dòng)和持續(xù)中，眾多炎性細(xì)胞因子發(fā)揮了重要作用[8-9]，其中最重要的IL-1和TNF-α，兩者通常同時(shí)存在，協(xié)同作用，并互相促進(jìn)。它們通過(guò)活化內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，將血液中與黏附分子相互作用的白細(xì)胞聚集到關(guān)節(jié)腔而發(fā)揮致炎作用[10]；促進(jìn)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞合成并釋放前列腺素E2，誘發(fā)滑膜炎[11]；合成并釋放膠原酶，促進(jìn)分泌纖維蛋白溶酶原激活劑，轉(zhuǎn)換纖維蛋白溶酶原成纖維蛋白溶酶，從而降解纖維蛋白，使軟骨基質(zhì)崩解[12]。IL-1中發(fā)揮生物學(xué)活性的主要為IL-1β，參與RA的軟骨破壞和骨侵蝕，因此，IL-1β和TNF-α在RA復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。CIA模型大鼠血清中IL-1、IL-1β和TNF-α水平在治療前顯著升高，治療后明顯下降，提示IL-1、IL-1β和TNF-α水平的高低可在一定程度上體現(xiàn)CIA模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥的嚴(yán)重程度[13]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，各造模組左踝關(guān)節(jié)腫脹率明顯升高（P < 0.01），經(jīng)艾拉莫德治療后CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹率明顯下降，且根據(jù)關(guān)節(jié)腫脹率隨治療時(shí)間的變化情況，提示艾拉莫德較甲氨蝶呤起效更快；經(jīng)艾拉莫德治療后的CIA大鼠滑膜組織病理最接近空白對(duì)照組；艾拉莫德可明顯降低CIA大鼠血清IL-1、IL-1β、TNF-α水平。本次實(shí)驗(yàn)也證明了艾拉莫德可通過(guò)下調(diào)IL-1、IL-1β、

TNF-α水平，從而改善關(guān)節(jié)滑膜病理，發(fā)揮抗炎、保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨、緩解RA病情的作用。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以使臨床醫(yī)師更加了解艾拉莫德的抗炎作用機(jī)制，對(duì)治療RA可起到一定指導(dǎo)作用。本研究不足之處是艾拉莫德僅設(shè)立一個(gè)劑量組，量效關(guān)系體現(xiàn)不明確，尚待今后更多濃度梯度實(shí)驗(yàn)。

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收稿日期：2016-10-23；修回日期：2016-12-08