高秀妹 曹紅收 劉占艷/山東省無棣縣畜牧獸醫(yī)局

如何提高ELISA測定的準確性

高秀妹 曹紅收 劉占艷/山東省無棣縣畜牧獸醫(yī)局

近幾年，畜產品質量安全意識與日俱增，動物疫病形勢復雜化，基層動物疫病防控部門做好動物疫病篩查工作顯得尤為重要。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）因其具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點被廣泛應用于血清、尿、飼料等樣品篩檢中。ELISA試驗看似簡單但在實際的操作中，影響測定結果的因素較多，稍有不慎便會導致弱板、白板、花板等不正常現(xiàn)象或假陽性、假陰性等異常結果。筆者對ELISA測定過程中出現(xiàn)一些問題進行了分析和總結，要想做好ELISA試驗需三個方面著手。

一、試劑

檢測試劑應選擇正規(guī)廠家、靈敏度高、特異性好、操作方便省時的試劑，切忌混用同廠家生產的不同批號的試劑。另外，試劑在使用前應平衡至室溫（25℃）,這樣可以避免試驗反應不充分、弱陽性樣品檢測假陰性結果等現(xiàn)象的發(fā)生。此外，稀釋試劑的水必須使用重蒸水或去離子水，其他水因雜質過多或有酸堿度都會影響檢測結果的準確性。

二、樣品

1.樣品處理。ELISA測定結果的判定是通過辣根過氧化物酶（HRP）與特異性結合產生的抗原-抗體復合物相互作用后顯色與否來實現(xiàn)的。對樣品篩選或處理要嚴格，否則會直接導致結果呈假陽性或假陰性等異常現(xiàn)象。如溶血和被細菌污染的樣品、冰箱中保存過久的樣品等導致假陽性出現(xiàn)；反復凍融會使樣品效價降低，導致假陰性出現(xiàn)。一般來說，一周內測定的4℃～8℃冷藏保存，一周后測定的-20℃冷凍保存，長期保存多次測定的樣品要分裝冰凍保存。

2.樣品稀釋。凡是ELISA檢測試劑盒，均要求將樣品稀釋至適當?shù)谋稊?shù)，并且不同試劑盒對樣品稀釋倍數(shù)均有嚴格規(guī)定，以降低非特異反應的概率，同時保證試驗的靈敏度和特異性。若操作者未能理解其意義，沒有嚴格按照說明書操作，導致移取計量不精準，造成樣品稀釋倍數(shù)相差甚遠，那么檢測結果肯定會出現(xiàn)嚴重偏差。

三、操作

1.加樣。首先加樣不可太快，否則無法保證加樣劑量的準確性和均一性。其次要避免將液體加在反應孔壁上部，可能會導致非特異性吸附。此外，要做到一份樣品一個移液搶頭，以防交叉污染。

2.溫育。溫育是ELISA測定中的一個關鍵環(huán)節(jié)，只有在一定適宜的溫度和與之相對應的特定時間，液相中的抗原（抗體）才能與固相載體上的特異抗體（抗原）充分結合。不同試劑盒有不同的溫育溫度和時間的要求，應嚴格按試劑盒說明操作，不能人為改變。此外，微孔板溫育時要加貼封片，這樣可以防止孔內液體蒸發(fā)或水珠等雜質滴入孔內影響檢測結果。

3.洗板。洗板是將溫育過程中液相非特異性成分與反應中固相載體的抗原（抗體）結合產生的抗原抗體清除出去，從而保證ELISA測定的特異性。同樣，每個試劑盒對洗板的次數(shù)和侵泡時間都有明確規(guī)定，絕不能擅自更改。此外，洗滌液應現(xiàn)用現(xiàn)配，洗板時不要讓洗液溢出，每次甩板拍干后的吸水紙一定要更換，尤其是拍過酶標記物的吸水紙，否則影響試驗結果。

4.顯色。一般來說，顯色時間過短，結果偏低，顯色時間過長，對照值偏高或非特異性顯色概率增加，因此，顯色一定要嚴格按照說明書要求控制好時間。此外，不同試劑盒對酶標儀的波長有明確要求，上機時需稍加注意。

此外，在反應板上的整個操作過程，操作手法應一致，加樣時避免產生氣泡，以免反應不完全或比色結果不準確。

總之，只要操作者按照說明書要求操作，專心細致，精益求精，就一定能大大降低異常結果出現(xiàn)的概率，體現(xiàn)ELISA試驗的優(yōu)越性。