劉維紅 （山東省臨沂市畜牧獸醫(yī)檢測中心 276000）

酶聯(lián)免疫吸附法在畜產(chǎn)品獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

劉維紅 （山東省臨沂市畜牧獸醫(yī)檢測中心 276000）

本文簡要介紹了酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的原理與類型，概述了ELISA技術(shù)在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用及ELISA操作過程中應(yīng)該注意的問題。

獸藥殘留是“獸藥在動物源食品中的殘留”的簡稱，獸藥殘留是指動物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及(或)其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)。隨著人們對食品安全的重視和對獸藥濫用造成危害的認(rèn)識加深，獸藥殘留分析現(xiàn)在已變得迫切和重要[1]。用于測定獸藥殘留的方法有很多，有高效液相色譜法(HPLC)、高效薄層色譜法(HPTLC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液質(zhì)聯(lián)用法(LCMS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法(CE-MS)[2]，這些方法對樣品的前處理過程較繁瑣，操作復(fù)雜，耗時長，難以滿足現(xiàn)場快速測定樣品的要求。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)具有檢測快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，成為快速檢測獸藥殘留的有效手段。

1 酶聯(lián)免疫吸附法的原理與類型

ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的簡稱，是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合的一種具有高特異性和高敏感性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)[3]。ELISA法既可以用來測定抗原也可以用來測定抗體。常見的類型有：（1）雙抗體夾心測抗原：此法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原；（2）雙抗原夾心測抗體：此法中受檢標(biāo)本不需要稀釋，可直接用于測定；（3）間接法測抗體此法主要用于傳染病的檢測。優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法；（4）競爭法測抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不容易被除去或不容易得到足夠純度的抗原時，可用此法檢測特異性抗體；（5）競爭法測抗原 此法多用于測定小分子激素或小分子藥物；（6）捕獲包被法測抗體 此法主要用于病毒性感染的早期診斷；（7）ABS-ELISA(親和素-生物素系統(tǒng)-ELISA)由于此法較普通ELISA法多了兩種試劑，增加了操作步驟，在實(shí)際檢測中此法應(yīng)用較少。

2 ELISA法在畜產(chǎn)品獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

（1）獸藥殘留的特點(diǎn)是樣品中殘留物水平低，樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，不易從樣品中分離純化殘留物，因此，獸藥殘留分析是復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量組份的分析技術(shù)。樣品的分離純化是獸藥殘留分析中最費(fèi)時和和勞動強(qiáng)度最大的步驟[4]。但隨著研究的深入和技術(shù)的完善，對樣品的前處理由原樣品的復(fù)雜處理與抽提發(fā)展為只需要高度純化的過程，加速了其在實(shí)際檢測中的應(yīng)用[5]。（2）雖然ELISA技術(shù)具有高特異性和高靈敏性，但其對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分，對結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)。再加上大部分獸藥為小分子量的藥物(MW＜2500)，一般不具有免疫原性，很難刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。近年來隨著小分子化合物免疫分析技術(shù)的發(fā)展，目前幾乎所有常見的獸藥殘留都建立了ELISA檢測方法，檢測樣本多樣，主要有動物組織(包括肌肉、肝臟、腎臟等)、蛋、乳、蜂蜜、飼料、尿液、毛發(fā)等[6]。

3 ELISA操作注意要點(diǎn)

3.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）試劑盒及實(shí)驗(yàn)過程中要用到的所有試劑要恢復(fù)至室溫；（2）不同批次的試劑盒不要混用；（3）不用過保質(zhì)期的試劑盒；（4）準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)過程中所用的吸水紙、移液器及吸頭，檢查酶標(biāo)儀和恒溫培養(yǎng)箱是否處于工作狀態(tài)；（5）將所需的酶標(biāo)板板條插入酶標(biāo)板架上，將剩下未使用的板條用自封袋密封后，立即保存于2～8℃環(huán)境中；（6）各試劑在使用前要搖勻，混合時應(yīng)避免氣泡的出現(xiàn)；（7）檢測時盡量減少酶標(biāo)板上方空氣的流動。

3.2 實(shí)驗(yàn)操作過程

3.2.1 加樣 加樣時注意要把所加物加到板孔底部，不可加在板孔上部，不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣一般用微量加樣器，每次應(yīng)更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。要注意加液量是否一致，避免多加漏加現(xiàn)象的發(fā)生。加完所有液體后注意液體的混勻。

3.2.2 溫育 不同的試劑盒要求的反應(yīng)溫度、時間不同，溫度過高過低或者是時間過長或過短都會影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)注意溫育的時間和溫度應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證時間準(zhǔn)確，一個人一次不宜同時多于兩塊板操作、測定。

3.2.3 洗滌 洗滌雖不是一個反應(yīng)步驟，但也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗，可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。ELISA就是通過通過洗滌來清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。倒掉板孔中液體，在每孔中加入規(guī)定數(shù)量的洗滌液，充分洗滌3～5次，每次浸泡15～30s，最后倒掉板孔中的洗滌液，應(yīng)將酶標(biāo)板倒置在干凈的吸水紙上，拍干。

3.2.4 顯色 顯色是ELISA操作中最后的一步溫育反應(yīng)，此時是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的反應(yīng)過程。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時間一般不需要嚴(yán)格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。

3.2.5 讀數(shù) 讀數(shù)前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，但應(yīng)盡量避免刮花表面。加完終止液后要混勻，要在規(guī)定時間內(nèi)讀數(shù)，液面不能有大的氣泡。操作時室溫最好在15～30℃之間，使用前先預(yù)熱儀器15～30min，以使讀數(shù)測定更穩(wěn)定。

4 小結(jié)

目前，ELISA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留分析中。在各種殘留分析方法中，ELISA法作為一種最常用的免疫分析法，具有成本低、速度快、靈敏度高、儀器設(shè)備簡單等特點(diǎn)，適合于大批量樣品的快速分析，降低了檢測成本，已成為獸藥殘留分析方法中不可或缺的一種方法。

[1] 潘孝成, 祁克宗, 孫國仁等. 獸藥單克隆抗體研究進(jìn)展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2005, 26(4)∶ 31-33.

[2] 黃雪英, 沈丹. 獸藥殘留檢測技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展方向[J]. 中國獸藥雜志, 2014, 48(7)∶ 66-69.

[3] 伏旭, 李培武, 賀莉等. 酶聯(lián)免疫吸附法的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 氨基酸和生物資源, 2012, 34(3)∶ 41-44.

[4] 張素霞. 獸藥殘留分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 動物保健, 2005(9)∶ 30-33.

[5] 萬宇平. ELISA在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用[J]. 動物保健, 2005(6)∶38-39.

[6] 張澤英. 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用[J]. 湖北畜牧獸醫(yī), 2013, 34(10)∶ 59-61.

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