蒙 苗，吳文林

（泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362000）

對蝦Toll樣受體通路研究進(jìn)展*

蒙 苗，吳文林

（泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362000）

對蝦是我國重要的海水養(yǎng)殖品種，但頻繁爆發(fā)的病害威脅著對蝦養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。Toll通路是對蝦重要的免疫應(yīng)答通路，在對蝦的抗病原體感染中起重要作用。文章綜述了國內(nèi)外關(guān)于對蝦Toll通路的最新研究進(jìn)展，總結(jié)了國內(nèi)外的研究成果，指出對蝦Toll通路研究的重要意義和未來的研究方向。

對蝦；Toll通路；研究進(jìn)展

對蝦是海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種之一，在我國海洋農(nóng)業(yè)中發(fā)揮重要作用，廣東、福建、海南、廣西、浙江是我國主要的對蝦養(yǎng)殖區(qū)域。2014年全國對蝦類養(yǎng)殖總產(chǎn)量為174.7萬噸 (中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，2015年)，年產(chǎn)值近千億元，從業(yè)人員超過100萬人，創(chuàng)造了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

但是，近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖強(qiáng)度的增加以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，特別是各類病毒及細(xì)菌性疾病的頻繁暴發(fā)，導(dǎo)致養(yǎng)殖對蝦病死率高，經(jīng)濟(jì)損失十分嚴(yán)重，影響蝦農(nóng)和公司收益，甚至導(dǎo)致部分蝦農(nóng)絕收破產(chǎn)。因此農(nóng)戶在養(yǎng)殖過程中廣泛使用抗生素，導(dǎo)致病原菌的耐藥性以及藥物殘留超標(biāo)問題，嚴(yán)重影響了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和產(chǎn)品品質(zhì)，影響人民健康。所以急需通過生物學(xué)手段，研究蝦體免疫調(diào)控，從而尋找到有效提高蝦體免疫力及抗病力的方法，并運(yùn)用到對蝦的人工養(yǎng)殖中。

與脊椎動物不同，目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為對蝦不具備獲得性免疫系統(tǒng)，只具有依靠體液免疫和細(xì)胞免疫的先天性免疫系統(tǒng)。細(xì)胞免疫包括吞噬作用、結(jié)節(jié)形成、黑化以及整合素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而體液免疫包括proPo級聯(lián)反應(yīng)凝血反應(yīng)、抗菌肽( AMPs)、凝集素、唐氏綜合癥細(xì)胞粘附分子( Dscam) 、Toll 和IMD通路，這些分子直接或間接觸發(fā)一系列防御反應(yīng)[1]。其中Toll通路是最重要的免疫通路之一。

Toll通路由Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）及其下游效應(yīng)因子如MyD88、TRIF、TRAM、TRAF等組成。TLR是進(jìn)化中比較保守的一個受體家族，是參與天然免疫的主要模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRR)之一。TLR能識別細(xì)菌、真菌、病毒及寄生蟲的多種病原相關(guān)分子模式PAMP(pathogen associatedmolecular pattern)(包括脂類、脂蛋白、蛋白質(zhì)、聚糖和核苷酸)，也能識別體內(nèi)的代謝產(chǎn)物或組織細(xì)胞損傷、壞死時釋放或分泌的分子，由TLRs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以誘導(dǎo)很多快速反應(yīng)的活化，產(chǎn)生如一氧化氮合成酶、抗菌肽、炎癥細(xì)胞因子、共刺激分子、趨化細(xì)胞因子等效應(yīng)分子，激活炎癥反應(yīng)，參與激活機(jī)體防御系統(tǒng)來抵抗病原微生物的入侵，是連接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁[2]。TLR廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物中，在引發(fā)免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，是連接先天性免疫與獲得性免疫的橋梁。至今，已在人、小鼠等脊椎動物和海洋動物等無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)存在15不同類型的同系物。

由于Toll樣受體通路在無脊椎動物天然免疫中的重要作用，科學(xué)家對其在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中的作用的研究日益增多，近年來，多種蝦類的TLR基因相繼被克隆，例如： 2007年Arts等人從斑節(jié)對蝦中克隆到了對蝦TLR基因[3，4]，發(fā)現(xiàn)該基因與昆蟲的Toll1和Toll5有較高的同源性，而跟昆蟲的Toll3和Toll4同源性較低，該基因在對蝦的鰓、消化道和肝胰腺中持續(xù)表達(dá)。2012年Wang等人克隆了2個凡納濱對蝦TLR基因[5]。2008年Mekata等人從日本囊對蝦中克隆到了TLR基因，他們發(fā)現(xiàn)日本囊對蝦基因編碼1009個氨基酸，在鰓、消化道、心臟、肝胰腺、血淋巴等組織均有表達(dá)，受肽聚糖刺激后高表達(dá)[6]。2008年Yang等人則克隆了中國明對蝦TLR基因[7]。其中日本囊對蝦已報(bào)道2種Toll樣受體基因[6]，凡納濱對蝦中已發(fā)現(xiàn)3種不同類型Toll樣受體基因[4，5]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，白斑綜合癥病毒感染可以引起凡納濱對蝦鰓部LvToll1、LvToll2和LvToll3基因的表達(dá)顯著升高，而感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)只能引起鰓中LvToll1基因的表達(dá)顯著升高[5]。我國對蝦免疫研究先驅(qū)之一的中山大學(xué)何建國教授等對對蝦Toll通路相關(guān)蛋白開展了多方研究，包括信號通路相關(guān)基因的克隆和表達(dá)調(diào)控，如對蝦TLR基因、Myd88、NF-kB的克隆和分子特性研究，2007年他們在世界上首次從南美白對蝦中克隆到對蝦TLR基因，發(fā)現(xiàn)對蝦的TLR有926個氨基酸殘基，具有與果蠅的TLR相似的LRR結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域，對蝦的TLR在對蝦組織中廣泛表達(dá)。隨后他們的研究發(fā)現(xiàn)，對蝦通過IKK、NF-KB通路調(diào)節(jié)抗菌肽的表達(dá)，同時該通路可能會被對蝦白斑病毒挾持，用于病毒的擴(kuò)增。他們的研究還發(fā)現(xiàn)，對蝦中存在多種MyD88分子[8-10]。這些研究成果主要集中在基因的克隆和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特征分析上，為無脊椎動物的天然免疫研究積累了很好的基礎(chǔ)。

2010年以后，有關(guān)對蝦Toll通路的研究更多集中在Toll通路的調(diào)控機(jī)制和影響因素上，如上海海洋大學(xué)的黃旭雄教授、戴習(xí)林教授等人開展了營養(yǎng)因素對對蝦Toll受體的影響研究，他們的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中銅水平對凡納濱對蝦鰓組織中Toll受體mRNA表達(dá)水平有顯著影響[11-13]。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院的宋曉玲等人則探討了益生菌對對蝦Toll受體表達(dá)的影響，結(jié)果表明飼料中添加地衣芽孢桿菌可有效提高Toll受體(Toll receptor) mRNA的相對表達(dá)量[14]。Deepika等人的研究發(fā)現(xiàn)，WSSV感染引起斑節(jié)對蝦Toll通路的TLR，MyD88，TRAF6轉(zhuǎn)錄上調(diào)，且持續(xù)時間長達(dá)72小時[15]。Liu，Huo等人通過RNAi方法，分析了南美白對蝦Toll通路的免疫應(yīng)答情況，發(fā)現(xiàn)敲降對蝦TLR表達(dá)導(dǎo)致對蝦抗菌肽表達(dá)下降，降低對蝦抗感染的能力[16，17]。

TLRs信號通路的激活可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，有利于機(jī)體抵抗病原微生物的感染，另一方面，TLRs的過度活化可能導(dǎo)致炎性因子的過度表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡與損傷。因此，TLRs信號通路的活化必須受到嚴(yán)密的控制并需要相應(yīng)的負(fù)向調(diào)控機(jī)制以使機(jī)體處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。山東大學(xué)的王金星教授等人就發(fā)現(xiàn)β-Arrestins負(fù)調(diào)控對蝦Toll通路，β-Arrestins 抑制對蝦NF-KB的轉(zhuǎn)錄活性[18]。

這些人的研究成果，極大地豐富了對蝦天然免疫知識，為對蝦疾病防控積累了理論基礎(chǔ)。但總體而言，國內(nèi)外有關(guān)對蝦Toll基因的研究剛剛起步，目前的成果主要集中在對蝦Toll通路相關(guān)基因的克隆以及病原體對Toll通路的表達(dá)影響上，對于非生物因素對對蝦Toll基因表達(dá)的影響以及影響機(jī)制，國內(nèi)外并未有深入研究。

免疫反應(yīng)不僅受生物體本身的基因調(diào)控，也受到生物體營養(yǎng)和環(huán)境因素的調(diào)控。Toll受體介導(dǎo)細(xì)胞啟動先天免疫反應(yīng)，對蝦類Toll受體基因的表達(dá)水平可以在一定程度上反映機(jī)體的免疫靈敏性，研究對蝦Toll通路的影響因素和調(diào)控機(jī)制，通過在養(yǎng)殖過程中控制這些影響因素來調(diào)控蝦體免疫抗病機(jī)能，增強(qiáng)養(yǎng)殖對蝦的身體素質(zhì)，是一條防治蝦類病害爆發(fā)的新途徑，不僅可減少使用抗生素和化學(xué)藥物，保護(hù)養(yǎng)殖環(huán)境，還能生產(chǎn)出綠色無公害水產(chǎn)食品，因而具有重要的理論價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

[1] Li F.，Xiang J.H.Recent advances inresearches on the innate immunity of shrimp in China[J].Developmental&Comparative Immunology. 2013，39(1-2):11-26.

[2] Zhang E.J.，Lu M.J.Toll-like receptor (TLR)-mediated innate immune responses in the control of hepatitis B virus(HBV)infection[J]. Medical Microbiology and Immunology，2015（204）:11-20.

[3] Arts J.A.J.，Cornelissen F.H.J.，Cijsouw T.，et al.Molecular cloning and expression of a Toll receptor in the giant tiger shrimp，Penaeus monodon[J]. Fish & Shellfish Immunology，2007，23(3):504-513.

[4] Yang L.S.，Yin Z.X.，Liao J.X.，et al.A Toll receptor in shrimp[J].Molecular Immunology，2007，44(8):1999-2008.[5] Wang P.H.，Liang J.P.，Gu Z.H.，et al.Molecular cloning，characterization and expression analysis of two novel Tolls( LvToll2 and LvToll3) and three putative Spatzle-like Toll ligands (LvSpz1-3) from Litopenaeus vannamei[J]. Developmental and Comparative Immunology，2012，36(2):359-371.

[6] Mekata T.，Kono T.，Yoshida T.，et al.Identification of cDNA encoding Toll receptor，MjToll gene from kuruma shrimp，Marsupenaeus japonicas[J].Fish & Shellfish Immunology，2008，24(1):122-133.

[7] Yang C.，Zhang J.，Li F.，et al. A Toll receptor from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis is responsive to Vibrio anguillarum infection[J].Fish & Shellfish Immunology，2008，24(5):564-574.

[8] Zhang S.，Qiu W.，Chen Y. G.，et al.Flightless-I (FliI) is a potential negative regulator of the Toll pathway in Litopenaeus vannamei[J]. Fish & Shellfish Immunology，2015，42(2):413-25.

[9] Wang P.H.，Gu Z.H.，Wan D.H.，et al.The shrimp IKK-NF-κB signaling pathway regulates antimicrobial peptide expression and may be subverted by white spot syndrome virus to facilitate viral gene expression[J].Cell Molecular Immunology， 2013，10(5):423-36.

[10] Wang P.H.，Gu Z.H.，Wan D. H.，et al.Litopenaeus vannamei Toll-interacting protein (LvTollip) is a potential negative regulator of the shrimp Toll pathway involved in the regulation of the shrimp antimicrobial peptide gene penaeidin-4 (PEN4)[J].Developmental and Comparative Immunology，2013，40(3-4):266-277.

[11] 黃旭雄，羅詞興，郭騰飛，等.對蝦Toll受體及其在蝦類營養(yǎng)免疫評價(jià)中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36(6):930-936.[12] 黃旭雄，羅詞興，郭騰飛，等.凡納濱對蝦Toll受體和溶菌酶mRNA組織表達(dá)的差異研究[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，21(1):28-32.

[13] 蘇建，戴習(xí)林，劉紅，等.羅氏沼蝦Toll樣受體基因cDNA片段的克隆及序列分析[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，23(3):338-343.

[14] 張盛靜，趙小金，宋曉玲，等.飼料添加益生菌對凡納濱對蝦腸道菌群、Toll受體及溶菌酶基因表達(dá)及抗感染的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2016，23(4):846-854.

[15] Deepika A，Sreedharan K，Paria A，et al. Toll-pathway in tiger shrimp(Penaeus monodon) responds to white spot syndrome virus infection: evidence through molecular characterisation and expression profiles of MyD88[J].TRAF6 and TLR genes.Fish & Shellfish Immunology，2014，41(2):441-54.

[16] Liu Y.，Song L.，Sun Y.，et al. Comparison of immune response in Pacific white shrimp， Litopenaeus vannamei，after knock down of Toll and IMD gene in vivo[J]. Developmental and Comparative Immunology，2016，60:41-52.

[17] Hou F.，He S.，Liu Y.，et al.RNAi knock-down of shrimp Litopenaeus vannamei Toll gene and immune deficiency gene reveals their difference in regulating antimicrobial peptides transcription[J]. Developmental and Comparative Immunology，2014，44(2):255-260.

[18] Sun J.J.，Lan J. F.，Shi X. Z.，et al.β-Arrestins negatively regulate the Toll pathway in shrimp by preventing Dorsal translocation and inhibiting Dorsal transcriptional activity[J]. Journal of Biological Chemistry，2016，291(14):7488-7504.

10.3969/j.issn.1007-550X.2017.05.005

S917.4

A

1007-550X（2017）04-0040-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號31470133）。

2017-04-06

蒙苗（1991-），男，壯族，廣西梧州人，大學(xué)本科，主要研究方向：天然免疫研究。