馮云霞

（濟(jì)源市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗(yàn)中心，河南濟(jì)源 459000）

雞傳染性支氣管炎實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

馮云霞

（濟(jì)源市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗(yàn)中心，河南濟(jì)源 459000）

雞傳染性支氣管炎病是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，該病的臨床和病理變化復(fù)雜多樣，又常繼發(fā)或并發(fā)其他細(xì)菌性、病毒性疾病，給該病的診斷帶來了很大的困難，本文結(jié)合多年臨床疾病診斷經(jīng)驗(yàn)，分別從病毒學(xué)、血清學(xué)、人工感染和分子生物學(xué)方面的闡述了該病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，從而為該病的確診診斷提供一定的技術(shù)支撐。

雞傳染性支氣管炎；實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)；RT_PCR技術(shù)

雞傳染性支氣管炎（IB）是由傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸傳染性的呼吸道和泌尿生殖道疾病。由于根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化只能作出初步診斷，確診需要靠病毒學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)等一系列實(shí)驗(yàn)室檢測方法?，F(xiàn)將病毒學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)診斷技術(shù)介紹如下。

1 病毒學(xué)診斷技術(shù)

1.1 病毒分離與鑒定

根據(jù)病史從感染雞的氣管、肺、腎、泄殖腔、輸卵管、盲腸、扁桃體、腺胃采樣。一般早期分離的首選部位是氣管、支氣管和肺，但感染后10～14d就不易分離到。制成懸浮液，加雙抗過夜，接種雞胚或氣管培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物，其中氣管培養(yǎng)最為敏感。經(jīng)典方法是通過尿囊腔途徑接種雞胚，37℃培養(yǎng)48～72h，取出部分尿囊液進(jìn)行血清學(xué)或分子生物學(xué)檢測，其余雞胚繼續(xù)培養(yǎng)6～7d，觀察侏儒胚變化。初次分離的病毒往往需要盲傳3～5代或以上才能出現(xiàn)明顯和有規(guī)律的雞胚矮小化現(xiàn)象。若為陽性，需進(jìn)一步通過病毒理化特性、病原性和抗原性檢測進(jìn)行鑒定。

1.2 干擾試驗(yàn)

雞傳染性支氣管炎病毒在雞胚中能干擾雞新城疫病毒產(chǎn)生血凝素，且這種干擾作用可以被同型特異抗血清所抑制，特異性強(qiáng)，敏感性強(qiáng)，操作簡便。具體做法是：取9～11日齡雞胚10～20枚，分成兩組，其中一組先按每枚胚0.1ml的劑量經(jīng)尿囊腔接種疑似IBV的雞胚液，另一組作為對(duì)照。孵化10h后，兩組同時(shí)經(jīng)尿囊腔接種新城疫病毒感染的雞胚尿囊液，劑量每枚胚0.1ml，繼續(xù)孵化36～48h，然后檢測每只雞胚的尿囊液的血凝價(jià)。若病料中有IBV存在，則試驗(yàn)組的雞胚尿囊液有50%以上的血凝價(jià)在1：20以下，而對(duì)照組的雞胚尿囊液則90%以上的血凝價(jià)在1：40或以上。該試驗(yàn)要嚴(yán)格按照上述時(shí)間操作，否則干擾作用會(huì)削弱或消失。

1.3 電鏡觀察

取培養(yǎng)的雞胚尿囊液或病料勻漿處理后，凍融3次，10000轉(zhuǎn)離心30min，上清液再以25000轉(zhuǎn)離心2h左右，取沉淀用少量蒸餾水懸浮、負(fù)染、電鏡下觀察形態(tài)。此法不適用于大批樣品檢查。

2 血清學(xué)診斷技術(shù)

血清學(xué)診斷方法包括病毒中和試驗(yàn)、血凝和血凝抑制試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)等。

2.1 病毒中和試驗(yàn)

應(yīng)用已知病毒檢測待測血清中的特異性抗體，廣泛應(yīng)用于IB野毒株的分離和鑒定及血清分型，可以進(jìn)行定性和定量檢驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)系統(tǒng)的不同，將病毒中和試驗(yàn)分為蝕斑減數(shù)試驗(yàn)、氣管環(huán)中和試驗(yàn)和雞胚中和試驗(yàn)，既可用固定血清稀釋病毒，也可用固定病毒稀釋血清。

2.2 血凝和血凝抑制試驗(yàn)（HI）

血凝抑制試驗(yàn)反應(yīng)一般具有簡便，快速的特點(diǎn)，適用于IB的快速診斷。IB的HI反應(yīng)與病毒中和試驗(yàn)具有很好的平行性，可以作為疫苗免疫效果的判定指標(biāo)，在臨床上作為輔助性的檢測手段。將含有IBV的雞胚尿囊液離心濃縮后，經(jīng)胰蛋白酶或卵磷脂酶C等的濾液處理后作為抗原，再按照微量法操作進(jìn)行血凝和血凝抑制試驗(yàn)。

2.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）

在進(jìn)行AGP試驗(yàn)之前，首先要進(jìn)行IB抗原的制備。IB抗原制備方法有許多，有直接將感染雞胚的尿囊膜或尿囊液作為IB抗原，即將感染的尿囊膜制成乳劑作為抗原，或者將乳劑濾液凍干，這樣不僅保留了IBV的完整性，而且還可以提供AGP診斷法的特異性。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA可以檢測傳染性支氣管炎病毒和抗體。在IB各種檢測技術(shù)中，ELISA具有其他血清學(xué)技術(shù)無可比擬的靈敏性，而且快速、簡便，表現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性。使用同一株病毒抗原包被就可檢出多種毒株的抗體水平，適用于大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查。

2.5 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)是檢測雞傳染性支氣管炎病毒的一種簡便、快速、靈敏、可靠的診斷方法，尤其是在IBV組織嗜性的抗原定位中，更體現(xiàn)出該方法的優(yōu)越性，但操作上較復(fù)雜，存在各毒株間的交叉反應(yīng)性，不宜做臨床快速診斷。

3 人工感染方法

將感染性的雞胚尿囊液通過氣管內(nèi)接種或點(diǎn)眼感染方式，接種1日齡SPF、雛雞或無母源抗體的健康雛雞，經(jīng)18～36h觀察臨床癥狀和病理變化。根據(jù)變化出的典型癥狀和病理變化進(jìn)行確診診斷。

4 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

目前廣泛用于IBV診斷及分型的分子生物學(xué)技術(shù)是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）分析技術(shù)。該技術(shù)具有敏感、特異、快速等特點(diǎn)，即可檢測感染雞胚尿囊液，也可直接檢測組織病料中的病毒。反轉(zhuǎn)錄-巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比RT-PCR更靈敏、特異，可以直接從感染病料中檢出IBV。RT-PCR技術(shù)雖大大提高了檢測的靈敏度，但PCR技術(shù)需要一定設(shè)備和對(duì)病料進(jìn)行特殊處理，操作需要具有一定的分子生物學(xué)背景，限制了其在臨床上的推廣應(yīng)用。此外，RT-PCR技術(shù)存在實(shí)驗(yàn)室污染的假陽性情況，因此用于臨床樣品檢測時(shí)一定要慎重，務(wù)必設(shè)立對(duì)照。

[1] 張國慶，劉晶，李廣興.雞傳染性支氣管炎實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)[J].畜牧與獸醫(yī)，2004，36（7）：19-20.