屈雁玲，馬俊麗，鄧甘露，尹玲，郭操，李易易，韓瑩,，蔡長景,，申竑,，曾珊,

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1.醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心 2.腫瘤科，湖南 長沙410008；3.湖南省分子放射腫瘤學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410008）

結(jié)腸癌是世界常見的惡性腫瘤之一，年新發(fā)病率位列第三[1]。在中國癌癥患者中，結(jié)腸癌發(fā)病率約為8.77%，為第五大常見惡性腫瘤，發(fā)病率和致死率有逐年上升趨勢[2]。目前對II、III期結(jié)腸癌治療是以手術(shù)為主的綜合治療，化學(xué)治療作為一種輔助治療在結(jié)腸癌綜合治療中起著重要作用。奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）是第三代鉑類化療藥物，殺死腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)理是抑制DNA合成，主要應(yīng)用于結(jié)腸直癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌等化學(xué)輔助治療?；熌退幨墙Y(jié)腸癌治療失敗的主要原因之一，并且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，能增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的逆轉(zhuǎn)劑成為了目前研究腫瘤耐藥的熱點(diǎn)。

甲基蓮心堿（neferine，Nef）是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提取出的一種雙芐基異喹啉生物堿[3]。有研究發(fā)現(xiàn)Nef具有抗腫瘤作用并可增強(qiáng)腫瘤化療敏感性。例如Nef可逆轉(zhuǎn)胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞的多藥耐藥性[4]。然而，Nef在結(jié)腸癌中研究尚未見報道。本研究通過觀察Nef對耐OXA結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株耐受性的影響，探討其對耐OXA細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機(jī)制，為Nef應(yīng)用于結(jié)腸癌的臨床化療增敏治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑及儀器 RARI-1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；青霉素鏈霉素雙抗、胎牛血清、胰蛋白酶（美國INVITROGEN公司）；CCK8試劑盒（日本同仁化工）。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（美國BD Biosciences）。兔抗人單克隆抗體 PARP、Bcl-2、Bax(美國 CST公司 )。HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（英國Abcam公司產(chǎn)品）；ChemiDoc? XRS+成像系統(tǒng)、Elx808型酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司），F(xiàn)ACS Canto II流式細(xì)胞儀（美國 BD Biosciences）。

1.1.3 藥物及制備 注射用OXA購自法國SANOFI-AVENTIS公司。將OXA配置成5 mmol/L母液，過濾除菌后分裝，-20 ℃閉光保存，2周內(nèi)使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及構(gòu)建 OXA耐藥株HCT116/OXA HCT116細(xì)胞用含10%胎牛血清RARI-1640和1%青鏈霉素雙抗的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的恒溫孵育箱中培養(yǎng)。將2 μmol/L OXA加入HCT116細(xì)胞中培養(yǎng)，連續(xù)4個周期，依次將 4、8、12、24、48 μmol/L 的OXA加入HCT116培基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，直至細(xì)胞可在含48 μmol/L OXA的培基中生長，此時HCT116/OXA細(xì)胞構(gòu)建成功。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制作用檢測 ⑴ HCT116/OXA、HCT116對OXA耐受性的測定:CCK8法檢測OXA對HCT116和HCT116/OXA細(xì)胞的增殖抑制作用。選取對數(shù)生長期的HCT116和HCT116/OXA制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后分別加入7個梯度濃度的OXA（0.1、1、10、20、50、100、1 000 μmol/L），同時設(shè)置空白對照組和調(diào)零孔，每組均設(shè)5個復(fù)孔。其中對照組加入細(xì)胞和完全培養(yǎng)基，調(diào)零組只加入完全培養(yǎng)基。分別于培養(yǎng)24、48 h時加入10%CCK8 100 μL，孵育3 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長檢測吸光度OD值。采用GraphPad Prism 5.0軟件計算各組細(xì)胞半數(shù)抑制率（IC50），IC50（%）=[1-（OD值實(shí)驗(yàn)組-OD 值調(diào)零組）/（OD 值對照組-OD 值調(diào)零組）]×100%；并計算耐藥指數(shù)（resistance index，RI）=耐藥株IC50/親本細(xì)胞IC50。⑵ Nef最適逆轉(zhuǎn)濃度的確定:CCK8法檢測Nef對HCT116/OXA細(xì)胞的增殖抑制作用。選取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后分別加入7個梯度濃度的Nef（2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L）， 同時設(shè)置空白對照組和調(diào)零孔，每組均設(shè)5個復(fù)孔。作用 24、48 h時加入 10% CCK8 100 μL，孵育3 h后檢測并計算IC50，檢測Nef對HCT116/OXA的毒性作用，計算細(xì)胞存活率（%）=（1-細(xì)胞抑制率%）。以細(xì)胞存活率為90%時的Nef濃度作為最適逆轉(zhuǎn)濃度。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=OXA組IC50/Nef+OXA 組 IC50。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的HCT116/OXA細(xì)胞，以胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板內(nèi)。設(shè)置空白組、OXA組、Nef組和Nef+OXA組。OXA處理濃度為對HCT116/OXA的IC50濃度；Nef處理濃度為最適逆轉(zhuǎn)濃度。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后給予不同處理。處理24 h時收集不同處理組細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌1次后加入300 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC避光室溫孵育15 min，然后加入5 μL PI避光孵育5 min后上機(jī)檢測。細(xì)胞凋亡率（%）=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/全部細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測 將HCT116/OXA細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)。設(shè)置空白組、OXA組、Nef組和Nef+OXA組。不同處理組經(jīng)處理24 h時PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，加入細(xì)胞裂解液裂解緩沖液（含1×磷酸酶抑制劑混合物）后，置冰上30 min后刮取細(xì)胞，以500 W功率超聲處理后在4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，取上清即為樣品總蛋白。Western blot法檢測 Bcl-2、Bax、PARP、p-PARP蛋白，采集圖片并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件分析。3個及以上樣本用Kuskal-Wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，計量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人結(jié)腸癌耐OXA耐藥株HCT116/OXA的建立

經(jīng)過9個月逐步遞增OXA濃度、間歇誘導(dǎo)，獲得可穩(wěn)定耐受OXA濃度為48 μmol/L且能正常生長的人結(jié)腸癌耐OXA細(xì)胞株HCT116/OXA。CCK8檢測結(jié)果顯示，OXA對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖有明顯抑制作用。與48 h比較，處理24 h時HCT116/OXA的增殖抑制作用隨濃度增加更為明顯（P＜0.001），因此選擇24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理時間（圖1）。不同濃度OXA處理HCT116及HCT116/OXA 24 h時，CCK8法檢測表明HCT116/OXA細(xì)胞對OXA的IC50濃度為（112.00±2.31）μmol/L，而HCT116細(xì)胞對OXA的IC50濃度為（21.00±0.64）μmol/L，因此HCT116/OXA的RI為5.33（圖2）。

圖1 不同濃度OXA作用24、48 h對HCT116/OXA細(xì)胞生長的影響Figure 1 In fluences of diあerent concentrations of OXA on growth of HCT116/OXA cells after culture for 24 and 48 h

圖2 不同濃度OXA作用24 h對HCT116/OXA與HCT116細(xì)胞生長的影響及IC50比較Figure 2 In fluences of diあerent concentrations of OXA on growth of HCT116/OXA and HCT116 cells culture for 24 h and comparison of IC50 values

2.2 Nef對HCT116/OXA耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

Nef對HCT116/OXA的細(xì)胞毒性成一定濃度依賴關(guān)系。CCK8檢測發(fā)現(xiàn)處理時間為24、48 h時，Nef對HCT116/OXA的作用差異不大（P＞0.05），因此選擇24 h作為Nef的處理時間（圖3A）。梯度濃度Nef作用HCT116/OXA 24 h時，CCK8檢測當(dāng)Nef濃度為（4.95±0.68）μmol/L時HCT116/OXA細(xì)胞存活率為90%，因此將5 μmol/L設(shè)為Nef的最適逆轉(zhuǎn)濃度。OXA單獨(dú)作用于HCT116/OXA細(xì)胞時IC50為（112.00±2.31）μmol/L；當(dāng)5 μmol/L的Nef與梯度濃度OXA作用HCT116/OXA細(xì)胞時IC50為（45.47±2.78）μmol/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.46，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖3B）。

2.3 Nef聯(lián)用OXA前后對HCT116/OXA細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，Nef處理HCT116/OXA細(xì)胞24 h時，細(xì)胞凋亡率無明顯變化（P＞0.05）；OXA（112 μmol/L）處理HCT116/OXA細(xì)胞24 h時，細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）；但與OXA組比較，Nef（5 μmol/L）+OXA處理組細(xì)胞凋亡率增加更為明顯（P＜0.001）（圖4）。

圖3 Nef對HCT116/OXA細(xì)胞生長及耐藥性的影響 A:不同濃度Nef作用HCT116/OXA細(xì)胞24、48 h細(xì)胞存活率；B:不同濃度的OXA與不同濃度的OXA聯(lián)合Nef（5 μmol/L）作用24 h對HCT116/OXA細(xì)胞生長的影響及IC50比較Figure 3 Influences of Nef on growth and durg-resistance of HCT116/OXA cells A:Survival rates of HCT116/OXA cells after exposure to different concentrations of Nef for 24 and 48 h; B:Influences of treatment of different concentrations of OXA or different concentrations of OXA plus Nef (5 μmol/L) for 24 h and comparison of IC50 values

圖4 細(xì)胞凋亡檢測Figure 4 Apoptosis analysis

2.4 Nef與OXA聯(lián)用前后對HCT116/OXA細(xì)胞PARP、p-PARP、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

Western blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，OXA處理HCT116/OXA細(xì)胞24 h時，促凋亡蛋白Bax表達(dá)呈上升趨勢，但與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與OXA組相比較，Nef+OXA組凋亡蛋白Bax、p-PARP/PARP表達(dá)水平均增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與Nef組比較，OXA組p-PARP/PARP表達(dá)增加（P＜0.05），但Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）（圖5）。

圖5 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測Figure 5 Determination of expressions of the apoptosis-related proteins

3 討 論

Nef是的一種雙芐基異喹啉生物堿，具有鈣離子通道阻滯劑作用，近年來其在腫瘤的研究愈來愈多。Qin等[5]發(fā)現(xiàn)Nef可通過抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的表達(dá)從而增加人慢性髓性白血病細(xì)胞株K562/G01對伊馬替尼的藥物敏感性。Huang等[6]也證實(shí)Nef聯(lián)合高熱可抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp和MDR1 mRNA的表達(dá)增加SGC7901/ADM的多藥耐藥性。此外，此類作用在乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR中也被驗(yàn)證[7]。Nef可通過激活P38 MAPK/JNK通路、抑制mTOR通路的激活而誘導(dǎo)自噬，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖[8]。在肺癌A549細(xì)胞株中，Poornima等[9]研究表明Nef可通過富集氧自由基、抑制PI3K/Akt/mTOR而誘導(dǎo)自噬，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖。另外有學(xué)者艾小紅等[10]證實(shí)在肝癌耐熱細(xì)胞株中，Nef可通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)增加肝癌細(xì)胞對阿霉素的藥物敏感性。但Nef與結(jié)腸癌細(xì)胞的相關(guān)性卻未見報道。

結(jié)腸癌化療耐藥成為結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的主要原因。目前大量研究致力于增加結(jié)腸癌的藥物敏感性。結(jié)腸癌化療耐藥的主要機(jī)制有錯配修復(fù)基因的缺失[11]、CpG島甲基化[12]、KRAS、P53基因突變[13-14]、慢性缺氧[15]、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]、細(xì)胞亞群存在[17]等。其中細(xì)胞凋亡也是導(dǎo)致結(jié)腸癌耐藥性的機(jī)制之一。Bcl-2、Bax是細(xì)胞凋亡家族中的重要成員，Bcl-2/Bax的比例下降則提示細(xì)胞凋亡增加[18]。Bcl-2與結(jié)腸癌耐藥相關(guān)[3]；細(xì)胞凋亡的減少可誘發(fā)基因突變、免疫紊亂，從而致使細(xì)胞對缺氧和乏養(yǎng)耐受增加，從而對抗癌藥物和放療射線產(chǎn)生抵抗[19]；Yang等[20]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中，結(jié)締組織生長因子可通過FAK/MEK/ERK通路上調(diào)Bcl-2的表達(dá)從而減少細(xì)胞凋亡，從而增加對5-氟尿嘧啶的耐藥性。然而，Manne等[21]研究107例南美和149例高加索結(jié)腸癌患者時發(fā)現(xiàn)Bcl-2的高表達(dá)提示遠(yuǎn)端結(jié)直腸腺癌預(yù)后較好。這可能提示人種、腫瘤部位的不同，Bcl-2的表達(dá)高低與結(jié)腸癌的預(yù)后不同，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

有研究[22]表明，miR-409-3p可通過下調(diào)Beclin-1介導(dǎo)的自噬作用增加結(jié)腸癌細(xì)胞對OXA的敏感性。另有研究指出結(jié)腸癌患者對OXA產(chǎn)生耐藥性可能與lncRNA長基因間的非編碼RNA 152（LincRNA00152）有關(guān)，LincRNA00152通過修飾Erb-b2受體酪氨酸激酶4來減少結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡從而產(chǎn)生耐藥性[23]。Wang等[24]研究表明轉(zhuǎn)染Bcl-2促凋亡家族中BNIP3質(zhì)粒的結(jié)腸癌細(xì)胞對OXA的敏感性增加。另有學(xué)者指出下調(diào)PI3K的催化亞基p110β可通過抑制OXA所致的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯來增加結(jié)腸癌對OXA的敏感性[25]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Nef可增加HCT116/OXA細(xì)胞對OXA的敏感性，同時發(fā)現(xiàn)Bax的表達(dá)水平增加，Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，表明Bcl-2/Bax可能參與了HCT116/OXA細(xì)胞耐藥，提示Nef可能通過下調(diào)Bcl-2/Bax表達(dá)水平逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌耐OXA細(xì)胞株HCT116/OXA的耐藥性。但是Nef如何調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡還需要更加深入探討。在接下來的研究中，有必要構(gòu)建另一株惡性程度不同的結(jié)腸癌耐OXA細(xì)胞株，比較并研究Nef對其他結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥增敏作用，并通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為結(jié)腸癌化療增敏提供新的思路和方法。

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