錢長根 周素梅 朱造杰 屠娟麗 秦 偉 嚴(yán)成其

（1.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江嘉興314036；2.嘉興碧云花園有限公司，浙江嘉善314113；3.浙江省嘉善縣干窯鎮(zhèn)農(nóng)技水利服務(wù)中心，浙江嘉善314107；4.嘉興中瑞生物科技有限公司，浙江嘉興314002；5.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江杭州310021）

草莓通常用匍匐莖繁殖育苗，生長期間易受病毒病、炭疽病、灰霉病、疫病等多種病害危害，其中以病毒病種類最多、防治最為困難。據(jù)報(bào)道，草莓病毒病和類病毒病的種類繁多，約有28種左右，主要有草莓輕型黃邊病毒（SMYEV）、草莓鑲脈病毒（SVBV）、草莓皺縮病毒（SCrV）和草莓斑駁病毒（SMoV）等。受病毒侵染的草莓苗，初期癥狀并不明顯，病株僅輕微矮化，后期草莓植株長勢逐漸變?nèi)鮗1]。當(dāng)田間有大量植株表現(xiàn)出受病毒危害癥狀時(shí)，病毒已經(jīng)大量存在于病株體內(nèi)，很難再有效地控制其傳播和蔓延，草莓產(chǎn)量和果實(shí)質(zhì)量嚴(yán)重下降。因此，防治草莓病毒病最有效的方法是持續(xù)培育新品種取代原有主栽品種，以實(shí)現(xiàn)品種的更新?lián)Q代，或通過無病毒草莓原原種苗的生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)品種的提純復(fù)壯，避免病毒危害。由于我國目前草莓主栽品種大多數(shù)從國外引進(jìn)，用現(xiàn)有主栽品種培育無病毒草莓苗，實(shí)現(xiàn)品種提純復(fù)壯是草莓預(yù)防病毒病一條現(xiàn)實(shí)而有效的途徑。

1 草莓無病毒苗培養(yǎng)的理論依據(jù)

1.1 病毒在植物體內(nèi)分布不均勻

研究表明，病毒在草莓等植物體內(nèi)的分布是不均勻的，頂端分生組織一般無病毒或只帶有濃度很低的極少量病毒，病毒數(shù)量、濃度隨著與莖尖、根尖距離加大而增加。在草莓等植物體內(nèi)，病毒一般通過維管束組織移動(dòng)、蔓延，而頂端分生組織中不存在維管束組織，病毒只能通過胞間連絲在細(xì)胞間緩慢移動(dòng)，難以入侵生長狀態(tài)高度活躍的莖尖或根尖組織[2～3]。而且，頂端分生組織的細(xì)胞分裂活動(dòng)極其旺盛，其內(nèi)源激素水平和代謝活性均非常高，病毒難以復(fù)制和增殖，從而使草莓根尖或莖尖頂端分生組織的病毒帶毒率極低，因此利用根尖或莖尖分生組織培育無病毒苗的成功率非常高。

1.2 植物細(xì)胞全能性學(xué)說

根據(jù)植物細(xì)胞的全能性學(xué)說，植物體任何一個(gè)細(xì)胞都帶有能發(fā)育成完整植株的全套遺傳信息，在離體培養(yǎng)條件下，這些遺傳信息能完全表達(dá)，形成與母體相同的完整植株。草莓莖尖、根尖分生組織細(xì)胞同樣帶有草莓植株的全套遺傳信息，在離體培養(yǎng)條件下，同樣能培養(yǎng)出具備草莓主栽品種優(yōu)良性狀的優(yōu)質(zhì)無病毒草莓苗。

2 草莓無病毒苗組培快繁技術(shù)

2.1 無菌系的建立

（1）外植體選取與采集：在苗期精心選取健壯無病的草莓苗進(jìn)行標(biāo)記，待其匍匐莖長出頂芽時(shí)，選取、采集標(biāo)記過的草莓苗中生長良好的匍匐莖頂芽帶回實(shí)驗(yàn)室，作為草莓離體培養(yǎng)的外植體。（2）外植體處理：選擇生長充實(shí)而小葉尚未展開的匍匐莖頂芽，切下2～3cm長，用自來水沖洗2～3h后，在超凈臺(tái)上進(jìn)行消毒滅菌處理。消毒處理時(shí)，先用小鑷子摘除匍匐莖外圍較大的葉片，而后用70%～75%酒精消毒20～30s，再置于0.1%升汞溶液中消毒6～8min或放在10%漂白粉上清液中浸泡10～15min，最后用無菌水沖洗6～8次。滅菌時(shí)搖動(dòng)滅菌容器，使草莓組培外植體與消毒滅菌藥劑充分接觸。在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%Tween20或Tween80濕潤劑，滅菌效果更好[4]。（3）誘導(dǎo)分化培養(yǎng)：切取芽下莖段，接種于MS+6-BA 0.5～3mg/L的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上。接種前培養(yǎng)基中加入白糖3%、瓊脂粉0.5%～0.6%，pH值調(diào)至5.8。每瓶內(nèi)接種外植體1～3個(gè)，接種后移至培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)3～4周。培養(yǎng)室要求光照強(qiáng)度為1500～2500Lx，光照時(shí)間12～15h/d，室內(nèi)溫度22±4℃。

2.2 脫毒培養(yǎng)

（1）莖尖培養(yǎng)：一般在每年的5～6月份，取經(jīng)過誘導(dǎo)分化培養(yǎng)出的草莓無菌小苗置于實(shí)體顯微鏡下，用小鑷子由外及里層層剝?nèi)デo尖幼葉和鱗片，找到帶1～2個(gè)葉原基的生長點(diǎn)，用接種針挑出0.3～0.5mm莖尖生長點(diǎn)，將生長點(diǎn)接入MS+6-BA 0.5～3mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種1～2個(gè)。培養(yǎng)室光照強(qiáng)度為1500～2500Lx，光照時(shí)間12～15h/d，溫度22±4℃，培養(yǎng)時(shí)間3～4周[5]。（2）防止褐化：草莓莖尖培養(yǎng)初期易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。引起褐化的原因很多，與品種、取材部位和時(shí)間、外植體大小、受傷害程度以及培養(yǎng)條件等有關(guān)。當(dāng)培養(yǎng)室溫度過高或光照過強(qiáng)時(shí)，多酚氧化酶活性提高，從而加速了外植體褐化。如果褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，應(yīng)及時(shí)更換培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)，并適當(dāng)降低培養(yǎng)室溫度和光照強(qiáng)度，必要時(shí)，在培養(yǎng)基中加活性炭、抗氧化劑和其他抑制劑等。一般情況下，培養(yǎng)20～25d后進(jìn)行培養(yǎng)基更換與轉(zhuǎn)接，以減輕或避免草莓外植體褐化[6～7]。

2.3 增殖培養(yǎng)

一般情況下，每年6～8月是草莓無病毒組培苗快繁中進(jìn)行增殖培養(yǎng)的最佳時(shí)間。此時(shí)宜將分化3mm以上、帶2片小葉的草莓苗新芽切離母體，并及時(shí)轉(zhuǎn)入MS+6-BA 0.6～1.0mg/L快繁增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行快繁增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)室光照強(qiáng)度為1500～2500Lx，光照時(shí)間12～15h/d，溫度22±4℃。一般增殖培養(yǎng)周期為4～5周，增殖培養(yǎng)可連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4～8代。

2.4 生根培養(yǎng)

（1）瓶內(nèi)生根：將通過增殖培養(yǎng)后形成的草莓組培增殖幼苗帶莖葉切離母株，作為新的培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)接入1/2 MS+NAA 0.3～0.8mg/L生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500～2500Lx、光照時(shí)間12～15h/d、溫度22±4℃，培養(yǎng)周期為3～4周。（2）瓶外生根：草莓組培苗還可轉(zhuǎn)至無菌濾紙上進(jìn)行保濕誘導(dǎo)生根培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)草莓組培苗瓶外生根。草莓組培苗瓶外生根培養(yǎng)前，可用組培幼苗蘸取植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)行生根誘導(dǎo)，適宜濃度為IBA 800mg/L。在進(jìn)行濾紙培養(yǎng)誘導(dǎo)生根時(shí)，要調(diào)節(jié)好培養(yǎng)室內(nèi)溫度、濕度和光照強(qiáng)度等條件，適宜溫度為20～30℃、濕度85%～95%、光照強(qiáng)度4000～10000Lx。

3 草莓無病毒原原種苗栽植和培育技術(shù)

3.1 組培瓶苗穴盤栽植和培育

（1）轉(zhuǎn)入溫室，栽前煉苗。草莓組培苗經(jīng)3～4周的生根培養(yǎng)，幼苗生出長度超過1cm的新根3條以上時(shí)，即可轉(zhuǎn)入溫室中進(jìn)行煉苗[8]。一般瓶內(nèi)煉苗時(shí)間控制在7～10d，其中打開瓶蓋煉苗時(shí)間為3～5d，盡量創(chuàng)造條件使幼苗逐漸適應(yīng)瓶外溫室內(nèi)的溫濕度及光照條件。煉苗過程中應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充水分，防止幼苗缺水萎蔫。（2）基質(zhì)裝盤，清洗幼苗。移植前須準(zhǔn)備好穴盤和潔凈基質(zhì)，常用基質(zhì)有草炭、椰糠、珍珠巖、蛭石等，基質(zhì)用1000mg/L多菌靈藥液消毒滅菌后裝入穴盤。向組培瓶內(nèi)倒入適量清水并搖動(dòng)瓶子，以松動(dòng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，而后取出組培苗置于清水中，輕輕地清洗掉粘附在幼苗根系上的培養(yǎng)基，然后將幼苗移植到裝有潔凈基質(zhì)的穴盤中。（3）及時(shí)移植，精心培育。先用木棒或竹簽在穴盤基質(zhì)中間挖一栽植穴，輕輕地將草莓組培幼苗的根部放入栽植穴中，使幼苗根系保持舒展?fàn)顟B(tài)，而后覆蓋基質(zhì)并壅實(shí)。移植后，將穴盤放入溫室或連棟大棚中的移動(dòng)苗床上，上面搭小拱棚、蓋保濕膜，并加蓋1層遮陽網(wǎng)，拱棚內(nèi)空氣相對(duì)濕度保持85%～95%。保溫保濕培養(yǎng)1周后，逐漸揭開小拱棚上的遮陽網(wǎng)和薄膜，先兩頭通風(fēng)，后兩側(cè)通風(fēng)，最后全部揭除遮陽網(wǎng)和保濕膜，使幼苗漸漸適應(yīng)溫室或大棚內(nèi)的生長環(huán)境。及時(shí)控溫調(diào)濕，防止幼苗失水萎蔫。

3.2 草莓穴盤苗床栽植和培育

3月上中旬，當(dāng)穴盤苗培養(yǎng)3～4周，根系布滿穴盤并長出穴盤底孔后，即移栽到專用苗床上進(jìn)行床栽培育。

3.2.1 翻耕筑畦，及時(shí)移栽

選用非重茬地種植，栽前1～2周翻耕整地，整平、整實(shí)、整細(xì)、整勻土壤，開溝筑畦寬1.8～2.0m。結(jié)合翻耕整地667m2施有機(jī)肥1000kg、過磷酸鈣25kg，使肥土均勻混合。3月上中旬定植無病毒原原種苗，每畦栽植1行，株距60～100cm。淺栽，栽后及時(shí)澆透定根水，并加強(qiáng)水分管理，確保幼苗成活[9]。

3.2.2 加強(qiáng)管理，培育壯苗

草莓無病毒原原種苗的壯苗標(biāo)準(zhǔn)為具有4張以上正常展開葉、根系發(fā)達(dá)、新根多、根莖粗1cm左右、單株重15g以上、無病蟲害。為育足、育好壯苗，須加強(qiáng)草莓無病毒原原種苗育苗期的田間管理，及時(shí)做好雨季排水、干旱澆水等工作。適時(shí)追肥，隨時(shí)摘除花蕾、老葉，及時(shí)整理藤蔓，使草莓原原種苗匍匐莖在畦面分布均勻，并做好培土壓蔓工作。同時(shí)，應(yīng)及時(shí)做好田間除草和草莓病蟲害防治等工作，確保培育足夠的壯苗。

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