張 弘, 張 英

(1. 中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院, 遼寧 沈陽, 110002; 2. 陜西省延安市人民醫(yī)院, 陜西 延安, 716000)

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吸煙對口腔癌前病變細胞中過氧化物還原酶1表達及絲裂原活化蛋白激酶信號通路的影響

張 弘1, 2, 張 英1

(1. 中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院, 遼寧 沈陽, 110002; 2. 陜西省延安市人民醫(yī)院, 陜西 延安, 716000)

吸煙; 口腔癌前病變; 過氧化物還原酶1; 絲裂原活化蛋白激酶

口腔癌是發(fā)生在口腔的惡性腫瘤的總稱，包括舌癌、口底癌、軟硬腭癌、上頜竇癌等以及發(fā)生于顏面部皮膚黏膜的癌癥，是頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一?？谇话装呤强谇话┳顬槌Ｒ姷陌┣安∽?，發(fā)病率約為10.47%, 單純白斑的癌變率約為4%～17.5%, 白斑合并上皮異常增生者癌變率約為36%[1]。吸煙是口腔癌前病變發(fā)生的主要風險之一，但其在口腔癌前病變中的作用機制尚不明確。Prx1是過氧化還原酶家族中的主要成員之一，其表達增高提示腫瘤細胞凋亡受到抑制[2]。MAPK信號通路則在腫瘤細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究探討吸煙對口腔癌前病變細胞株DOK中Prx1蛋白質(zhì)與mRNA以及MAPK家族中3種激酶磷酸化表達的影響，分析吸煙對口腔癌前病變的作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人口腔黏膜癌前病變細胞株DOK細胞購自上海富衡生物科技有限公司。Trizol試劑，Invitrogen。DMEM高糖液體培養(yǎng)基, HYCLONE。胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司。RTFQ-PCR試劑盒購自生興生物技術(南京)有限公司。高產(chǎn)量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems。RTFQ-PCR引物合成購自寧波康貝生化有限公司。一抗: p-JNK、p-ERK、p-p38, Cell Signaling Technology, Inc。Prx1購自Abcam公司。辣根過氧化物酶標記的二抗購自上海明睿生物技術有限公司。組織蛋白抽取試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。聚偏二氟乙烯膜購自深圳市凱宏膜環(huán)?？萍加邢薰?。免疫印跡試驗預染蛋白MAPKer購自杭州佐正生物科技有限公司。免疫印跡試驗封閉液II購自上海博谷生物科技有限公司。香煙煙變應原試劑購自北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應科。

1.2 細胞培養(yǎng)

DOK細胞株常規(guī)培養(yǎng)于含104U/L鏈霉素、104U/L青霉素、12%胎牛血清的DMEM高糖液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于5% CO2、37 ℃的孵箱內(nèi)，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。觀察組應用50 μL溶媒稀釋的香煙煙抗原浸液處理口腔癌前病變細胞株DOK 14 d, 對照組單純應用50 μL溶媒處理口腔癌前病變細胞株DOK 14 d。

1.3 觀察指標

應用倒置顯微鏡觀察2組DOK細胞形態(tài)變化。應用Trizol試劑分別提取觀察組與對照組細胞總RNA, 分光光度計測量總RNA質(zhì)量與濃度, cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA, RTFQ-PCR試劑盒定量擴增目的基因，應用相對定量方法進行結果分析，計算2-△△Ct。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參照，基因引物序列如下: GAPDH-R, 5′-tgtagaccatgtagttgaggtca-3′; GAPDH-F, 5′-aggtcggtgtgaacggatttg-3′; Prx1-R, 5′-tccccatgtttgtcagtgaa-3′; Prx1-F, 5′-gggtattcttcggcagatca-3′。

Western Blot檢測2組細胞中Prx1 蛋白的表達，以及MAPK家族p-JNK、p-ERK、p-p38表達情況。DOK細胞處理同RTFQ-PCR, 分別收集2組細胞，對組織樣品進行蛋白提取并用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進行蛋白定量，電泳分離蛋白，每個樣品上樣30 μg, 濕法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，封閉，一抗孵育: p-JNK(1∶1 000)、p-ERK(1∶2 000)、p-p38(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)。洗膜，二抗孵育：羊抗小鼠-HRP(1∶5 000), 羊抗兔-HRP(1∶5 000)。電化學發(fā)光顯色。應用Qantity one 4.62軟件灰度掃描，分析結果。

2 結 果

2.1 形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下觀察未處理前的DOK細胞呈不規(guī)則多邊形或梭形，觀察組與對照組均未見明顯變化。

2.2 Prx1 mRNA與蛋白的表達

觀察組Prx1 mRNA表達為(1.92±0.39), Prx1 蛋白表達為(0.76±0.22); 對照組分別為(1.01±0.17)、(0.60±0.18), 2組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 MAPK家族p-JNK、p-ERK、p-p38的表達

觀察組p-JNK表達為(0.42±0.01), p-ERK表達為(0.46±0.02), p-p38表達為(0.27±0.06); 對照組分別為(0.59±0.03)、(0.27±0.01)、(0.36±0.05), 2組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

口腔癌是世界第6大癌癥，平均每年發(fā)病人數(shù)達到50萬人，并且每年死亡人數(shù)高達25萬人。目前公認吸煙是口腔癌發(fā)生發(fā)展的主要風險因素[3]，吸煙者較非吸煙者罹患口腔癌的風險高7～10倍。研究[4]表明，吸煙可產(chǎn)生大量的活性氧簇(ROS)，ROS可氧化脂質(zhì)、多糖與蛋白質(zhì)，包括DNA與RNA。對于ROS引起的氧負荷，機體的抗氧化系統(tǒng)主要有抗氧化酶，如過氧化物還原酶(Prxs)。Prxs廣泛存在于真核及原核生物的細胞質(zhì)、細胞核中，是特異性巰基類抗氧化酶，通過催化和還原脂質(zhì)氫過氧化物，避免細胞受到進一步損傷，已知在哺乳動物中存在6種亞型，以Prx1在組織中含量最為廣泛與豐富。研究[5]發(fā)現(xiàn)Prx1具有刺激細胞增殖、促進細胞凋亡、參與細胞信號轉(zhuǎn)導及保護其他蛋白的氧化等作用?？谇话┣安∽兘M織白斑中，隨著異常增生程度的增加, Prx1表達增加，顯著高于正常組織[6]。此外, Prx1在前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達較高[7], 提示Prx1的高表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究中，觀察組Prx1 mRNA與蛋白均顯著高于對照組，提示觀察組細胞受損程度大于對照組。

MAPK信號通路在調(diào)控細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲與分化中發(fā)揮重要作用，主要包括JNK、ERK、p38三條信號通路。正常情況下, JNK、ERK、p38三條通路可促分化。在應激狀態(tài)下, ERK抗細胞凋亡而JNK、p38則促進細胞凋亡[8]。本研究中，觀察組p-JNK與p-p38顯著低于對照組，而p-ERK顯著高于對照組，提示觀察組細胞的抗凋亡作用顯著。有研究[9]顯示，香煙中的主要成分尼古丁通過提高p-ERK的表達促進非小細胞肺癌A549細胞的增殖。

國外學者體內(nèi)細胞實驗[10]發(fā)現(xiàn)，在Prx1高表達的細胞中，細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1活性受抑，進而抑制MAPK信號轉(zhuǎn)導通路下游的p38級聯(lián)反應; 而Prx1低表達的細胞中, p38與JUN顯著激活。在本次研究中，在香煙煙抗原浸液處理的觀察組中, Prx1高表達而p-JNK與p-p38表達降低, p-ERK表達升高，提示長期吸煙刺激口腔黏膜病變，可能通過誘導過氧化物還原酶1表達增高，調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶信號通路，活化JNK、ERK、p38磷酸化水平，繼而發(fā)揮抗細胞凋亡的作用，促使口腔癌前病變發(fā)展為口腔癌。

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2017-01-20

遼寧省衛(wèi)計委青年項目(20144Y0199)

張英

R 739.8

A

1672-2353(2017)13-230-02

10.7619/jcmp.201713084