李瑜琴，陳 玲

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的慢性傳染病?！?017全球結(jié)核病報告》指出，2016年，結(jié)核病仍是頭號傳染病，是全球范圍內(nèi)第九大致死性疾病。近年來，結(jié)核病患者由于診斷延遲、化療不當或管理不善等原因而導致越來越多的MTB對主流抗結(jié)核藥物產(chǎn)生了耐藥性，給結(jié)核病防控工作帶來嚴峻挑戰(zhàn)[1-4]。耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)是指MTB至少同時對利福平和異煙肼耐藥，其治療難度增加，需聯(lián)合二線抗結(jié)核藥物，但目前臨床上所用二線抗結(jié)核藥物不僅毒副作用較大、費用較昂貴，且整體控制效果較差；更為嚴峻的是，隨著二線抗結(jié)核藥物使用，廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug resistant tuberculosis，XDR-TB)已悄然出現(xiàn)并持續(xù)增加及擴散[3，5-6]，目前幾乎無特效藥物，且許多涂陽的耐藥患者至死仍具有傳染性，耐藥結(jié)核病已成為全球結(jié)核病防治的難題。近年來，隨著分子生物學技術(shù)發(fā)展，結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的診斷技術(shù)突飛猛進。本文通過檢索相關(guān)文獻，旨在對耐藥結(jié)核病實驗室診斷方法的研究進展進行綜述。

1 耐藥結(jié)核病流行現(xiàn)狀

世界衛(wèi)生組織(WHO)與國際防癆和肺病聯(lián)合會(International Union Against Tuberculosis and Lung Disease，IUATLD)于1994年建立了全球性抗結(jié)核藥物耐藥監(jiān)測計劃，2008—2013年第5輪監(jiān)測計劃中提到，XDR-TB已在全球100個國家報道，其中約9.0%的MDR-TB為XDR-TB[7]；截至2016年，抗結(jié)核藥物耐藥監(jiān)測計劃已覆蓋155個國家及地區(qū)，2015年全球新發(fā)結(jié)核病患者約1 040萬，其中約3.9%初治和21.0%復治結(jié)核病患者為MDR-TB，耐利福平或耐多藥結(jié)核病(MDR/RR-TB)患者約為58萬，其中約9.5%的MDR-TB為XDR-TB。我國一直是全球結(jié)核病高負擔國家，結(jié)核病新發(fā)人數(shù)位居全球第三，MDR-TB新發(fā)人數(shù)位居全球第二，僅次于印度[8]。2007—2008年全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查報告顯示，肺結(jié)核患者耐多藥(MDR)率為8.32%，廣泛耐藥(XDR)率為0.68%，估算每年新發(fā)MDR肺結(jié)核患者為12萬，每年新發(fā)XDR肺結(jié)核患者為1萬。全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告顯示，分離的MTB對二線抗結(jié)核藥物耐藥率為24.6%，MDR率為6.8%，XDR率為2.1%[9-11]。大多數(shù)結(jié)核病患者可通過早期診斷而得到合理治療，病死率較低，但估計新發(fā)結(jié)核病患者人數(shù)與報告登記患者人數(shù)缺口高達40%。因此，加強結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的早期診斷刻不容緩。

2 常規(guī)細菌學檢測方法

目前，耐藥結(jié)核病常規(guī)細菌學檢測方法主要是建立在MTB培養(yǎng)陽性基礎(chǔ)上，并根據(jù)MTB生長及代謝狀態(tài)進行判定。

2.1 傳統(tǒng)藥敏試驗 目前，耐藥結(jié)核病的診斷仍主要依靠傳統(tǒng)藥敏試驗，主要分為直接法和間接法。直接法是指涂片鏡檢確認陽性的臨床標本，經(jīng)處理后直接接種于含藥培養(yǎng)基；間接法是建立在MTB培養(yǎng)陽性基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)出的MTB接種于含藥培養(yǎng)基。直接法雖然較間接法報告結(jié)果快，但由于其接種量不易液化、污染不易控制及可能存在涂陽培陰等情況而導致臨床應用受限。目前，臨床常用的藥敏試驗方法是瓊脂比例法[12]，其能準確計算對某種藥物耐藥的MTB比例，且成本較低，適合在基層醫(yī)院應用；但由于MTB生長速度緩慢，傳統(tǒng)固體藥敏試驗通常需3個月才能獲得結(jié)果，易延誤耐藥結(jié)核病患者開展有效治療；再者，抗結(jié)核藥物濃度與耐藥結(jié)果關(guān)系密切，目前二線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗均存在可靠性及可重復性不足等問題[13]。

2.2 BacT/ALert 3D全自動細菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng) BacT/ALert 3D全自動細菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)由法國梅里埃公司研發(fā)，是一種集MTB快速生長培養(yǎng)及藥敏試驗為一體的全自動培養(yǎng)儀，其原理是利用微生物生長代謝過程中產(chǎn)生的二氧化碳(CO2)，通過培養(yǎng)瓶底部特殊的激光器及固定的傳感器連續(xù)檢測接種標本的培養(yǎng)瓶中的CO2及其變化，從而判斷有無MTB生長；藥敏試驗是將原始管分離的菌液倒入配置含藥的藥敏培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基中，然后置于培養(yǎng)儀中，根據(jù)MTB生長情況判斷耐藥性。BacT/ALert 3D全自動細菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)安全、環(huán)保、無放射性污染，且可自動監(jiān)測，與傳統(tǒng)改良酸性羅氏培養(yǎng)法相比具有安全、快速、能減少工作量等優(yōu)點[14]，但該系統(tǒng)投入成本較高，很難在基層醫(yī)院開展。

2.3 BACTEC-460TB檢測系統(tǒng) BACTEC-460TB檢測系統(tǒng)由美國BD公司生產(chǎn)，其工作原理與BacT/ALert 3D全自動細菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)基本相同，在培養(yǎng)系統(tǒng)中加入放射性同位素14C標記的棕櫚酸，MTB生長代謝過程中會特異性利用被標記的棕櫚酸，該檢測系統(tǒng)可自動檢測代謝產(chǎn)物14C的放射活性，換算成生長指數(shù)值后進行分析報告，一般10～14 d可檢測出陽性結(jié)果，同時還可進行相應的藥敏試驗。但BACTEC-460TB檢測系統(tǒng)采用放射性培養(yǎng)基，存在放射污染，目前已被MTB生長指示管(MGIT)960檢測系統(tǒng)取代[15]。

2.4 MGIT 960檢測系統(tǒng) MGIT 960檢測系統(tǒng)是指不含放射性培養(yǎng)基的BACTEC-460TB檢測系統(tǒng)，其原理是通過監(jiān)測培養(yǎng)管底部能被氧分子抑制的熒光指示劑而觀察MTB生長狀態(tài)，當培養(yǎng)管中有MTB生長時大量氧分子被消耗，原先被抑制的熒光指示劑被激活，在365 nm波長紫外光照射下出現(xiàn)熒光，即可判斷陽性結(jié)果。MGIT 960檢測系統(tǒng)不存在放射性污染，且具有檢出陽性率較高、耗時較短、特異性較高等優(yōu)點，但因試劑和檢測儀器昂貴而難以在基層醫(yī)院開展[16-17]。

2.5 Etest法 Etest法實際是一種改良瓊脂擴散試驗，其原理是將藥物以log2梯度稀釋成不同濃度，并用特殊技術(shù)固定于特制的塑料條(5 mm×50 mm)上，然后將藥條貼于處理過的含MTB的改良培養(yǎng)板表面并觀察其抑菌圈。Etest法是一種定量檢測方法，能同時測試多種藥物，5～10 d可以報告其藥敏結(jié)果；但該方法易受到其他因素影響，陰性率與假陽性率較高[18]，目前國內(nèi)尚未有該方法用于診斷MTB的報道。

2.6 微量快速顯色藥敏檢測法 微量快速顯色藥敏檢測法的原理是MTB在變色培養(yǎng)基基礎(chǔ)液中生長，當加入一定量結(jié)核藥物作用一定時間后，對藥物敏感的MTB減少，故不能使變色劑變色；對藥物耐藥的MTB活力無明顯降低，仍能增殖，使變色劑變色。微量快速顯色藥敏檢測法通過觀察培養(yǎng)基顏色及比較對照孔變化來判斷藥物敏感性，2～6 d可獲得結(jié)果；但該方法對菌液濃度要求較高，不易操作，精確性易受影響[19]，須專業(yè)人員在無菌條件下進行。

3 分子生物學檢測方法

分子生物學檢測方法主要包括MTB DNA提取、針對結(jié)核藥物耐藥位點設(shè)計引物、通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增與耐藥性有關(guān)的基因片段及分析PCR擴增產(chǎn)物進行耐藥性判斷等。

3.1 普通PCR技術(shù) DNA直接測序是檢測基因突變的最客觀、最直接的方法，即從MTB中提取DNA，設(shè)計相應藥物所對應基因片段的引物，PCR擴增后測序，與H37RV標準菌株基因組比較并判斷有無基因突變。普通PCR技術(shù)可準確檢測突變基因及突變類型，但費用較高、操作繁瑣、易出現(xiàn)假陽性，需特定的實驗室設(shè)備及專業(yè)人員進行，目前多用于科學研究。

3.2 Gene Xpert檢測系統(tǒng) Gene Xpert檢測系統(tǒng)由美國Cepheid公司研發(fā)，其原理是將樣本加入Gene Xpert反應盒后自動進行樣品純化、核酸擴增、目標序列測定。Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)作為WHO推薦的一種耐藥基因突變檢測方法，采用了Gene Xpert檢測系統(tǒng)，是針對MTB利福平耐藥基因rpoB的81bp利福平耐藥決定區(qū)設(shè)計引物、探針，在檢測有無MTB的同時檢測是否發(fā)生基因突變，從而判斷MTB是否對利福平耐藥[20]。BOEHME等[21]研究結(jié)果顯示，Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)檢測利福平耐藥性MTB的靈敏度和特異度分別為97.6%、98.1%。王霄等[22]應用Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)診斷肺外結(jié)核(淺表淋巴結(jié)結(jié)核)的陽性率為78.1%。Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)操作簡單，耗時較短，交叉污染較小，對環(huán)境和實驗室人員安全；但Gene Xpert檢測系統(tǒng)僅能檢測利福平耐藥情況，且該技術(shù)屬于國外進口，費用較昂貴，缺乏我國自主知識產(chǎn)權(quán)。超級Xpert(Xpert Ultra)作為第二代Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)，與液體培養(yǎng)靈敏度相當，檢測菌量極限可低至10 cfu/ml，能更準確地檢測利福平耐藥情況，但目前尚缺乏多中心研究進一步證實[8，23]。

3.3 高分辨熔解曲線技術(shù)(HRM) HRM由美國猶他大學與美國Idaho公司共同合作開發(fā)，是PCR擴增技術(shù)與熔解曲線分析技術(shù)結(jié)合形成的新技術(shù)[24]，其依據(jù)不同核酸分子GC含量、GC分布不同及解鏈時所形成的熔解曲線不同的原理，在PCR擴增完成后通過高分辨率儀器檢測擴增產(chǎn)物中飽和熒光染料的熒光強度變化而獲得特征性熔解曲線，通過與野生型熔解曲線比較而判斷序列是否突變及區(qū)分單個堿基的序列差異[25-26]。HRM無需序列特異性探針，已有相關(guān)商品化產(chǎn)品用于檢測包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素、喹諾酮類藥物在內(nèi)的抗結(jié)核藥物，該技術(shù)屬于我國自主研發(fā)產(chǎn)品，已逐步用于耐藥結(jié)核病分子診斷，但目前仍缺少系統(tǒng)的臨床研究。

3.4 線性探針(LPA) LPA通過設(shè)計被生物素修飾的特異性引物，經(jīng)過多重PCR擴增而使擴增產(chǎn)物攜帶生物素，然后將擴增產(chǎn)物變性，使擴增產(chǎn)物與特異探針進行雜交，采用酶免疫顯色法判定結(jié)果。LPA最短6 h可診斷出耐藥結(jié)核病，故被WHO推薦作為診斷耐藥結(jié)核病的主要方法之一[8]，與傳統(tǒng)藥敏試驗比較，其可極大地縮短耐藥結(jié)核病報告時間，且靈敏度和特異度較高；但受膜上探針限制而不能檢測所有類型耐藥結(jié)核病，目前已知的有德國HAI公司GenoType MTBDR和GenoType MTBDRsl檢測試劑盒。商業(yè)化的LPA試劑盒價格較高，且LPA檢測對實驗室條件及實驗室人員要求嚴格，故該技術(shù)在基層實驗室推廣使用受限[27-29]。

3.5 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)是一種新型核酸檢測方法，其基本原理是將大量不同的生物信息分子以高密度密集的方式有序地固定在玻璃上形成微陣列，當熒光標記的靶分子與芯片上的探針結(jié)合后，通過掃描即可進行量化分析。基因芯片技術(shù)可快速檢測MTB耐利福平和異煙肼3個基因(ropB、KatG、inhA)的常見突變位點[30-31]，準確率高，但只能檢測常見的突變基因，且費用較昂貴，需特定的實驗室設(shè)備及專業(yè)人員進行，目前多應用于科學研究。

3.6 全基因組測序(WGS) WGS是一種高通量測序技術(shù)，能更全面、精準地分析MTB全基因組的堿基序列[32]，充分了解其所包含的遺傳信息，如耐藥、分型等，并通過與不同個體或群體比對發(fā)現(xiàn)二者之間的遺傳特性及基因突變特點，從而加深對耐藥結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展的認識，并制定相應的治療策略，提高其檢出率；WGS已成為藥物敏感性檢測的另外一個策略。但WGS目前僅用于培養(yǎng)分離株，并未用于痰標本，且工作量較大、費用較高，測序后生物信息學分析更是錯綜復雜，故尚難以在臨床上推廣，多應用于科學研究[33]。

4 小結(jié)與展望

目前，MTB傳統(tǒng)藥敏試驗仍是耐藥結(jié)核病的診斷金標準，但其耗時較長、成本較高，有待進一步改進。近年來隨著分子生物學技術(shù)快速發(fā)展，涌現(xiàn)出大量MTB耐藥基因檢測技術(shù)，可快速、準確地檢測出針對某種抗結(jié)核藥物的突變基因，但并不是所有突變均提示耐藥，也不是所有耐藥均存在基因突變，目前還有許多抗結(jié)核藥物耐藥相應突變基因及其耐藥機制尚未明確。因此，結(jié)核病的防治工作尤其是耐藥結(jié)核病診治任重道遠，需全社會共同努力。

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