謝清清, 陳彩芳, 吳林德, 林志華

(1. 寧波大學 海洋學院, 浙江 寧波 315211; 2. 浙江萬里學院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用重點實驗室,浙江 寧波 315100)

受工業(yè)發(fā)展及城市廢棄物隨意排放的影響, 土壤和近海海域的重金屬污染日益嚴重。重金屬在環(huán)境中極其穩(wěn)定、不易被消除, 并能通過食物鏈積累和擴大, 嚴重威脅著生物的生存及人類的健康。鉛(Pb)是環(huán)境中最常見的七種重金屬之一, 被我國《重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃》列為重點綜合整治對象, 也是目前已篩選出的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)的一個重要組成部分[1-2]。已有研究表明 Pb能對許多無脊椎海洋動物, 如腹足綱軟體動物和雙殼類動物產(chǎn)生影響[3]。作為非必需金屬元素, Pb在生物體內(nèi)富集會促進活性氧自由基的生成, 提高機體的氧化壓力, 從而對機體造成氧化損傷。

金屬硫蛋白(Metallothionein, MT)是一種低分子量的蛋白質(zhì), 廣泛存在于大多數(shù)生物體內(nèi)。MT所富含的半胱氨酸巰基可與重金屬配位結(jié)合并將其排出體外, 在參與非必需金屬元素的解毒方面具有重要作用[4-5]。此外, MT在增進機體對外界刺激的應激反應和清除自由基抗氧化保護方面也有重要作用[6]。近年來, 貝類 MT, 不管是在基因還是蛋白水平均已開展了大量研究工作[7-14]。但大部分側(cè)重于探究MT與重金屬鎘(Cd)之間的關系, 對于 Pb與 MT之間是否具有相同的作用機制, 我們?nèi)灾跎佟?/p>

卵黃蛋白原(Vitellogenin, Vg) 是卵生動物卵黃中主要成分的前體, 主要存在于成熟雌性個體中,在雄性個體和幼體中表達量很少, 甚至不表達[15]。而在環(huán)境內(nèi)分泌干擾素(如 Cd、Pb等)誘導下, 雄性和幼體中 Vg也會相應表達[16]。此外, 研究還發(fā)現(xiàn) Vg具有抗氧化能力[17-18]。Nelson等[19]發(fā)現(xiàn)蜜峰能夠通過Vg清除體內(nèi)自由基來降低氧化壓力而延長壽命。而在貝類中, Zheng等[17]也發(fā)現(xiàn)華貴櫛孔扇貝Vg具有抗氧化活性。對貝類Vg基因的相關研究主要集中于扇貝、文蛤、泥蚶等少數(shù)經(jīng)濟貝類[17-18,20-22]。Chen等[20]克隆得到泥蚶Vg全長, 推測其具有多個金屬結(jié)合位點, 表明泥蚶Vg具有金屬結(jié)合能力; 且在1、3、6和9 μg/L Cd暴露28 d后, 泥蚶消化腺和血液Vg均顯著上調(diào), 表明其在泥蚶重金屬解毒中發(fā)揮重要作用。吳林德等[21]發(fā)現(xiàn)泥蚶消化腺 Vg表達量和 Pb脅迫具有一定的時間效應和劑量效應, 推測其抗氧化功能在Pb脅迫引起的氧化損傷中起作用。

泥蚶( Tegillarca granosa) , 俗稱血蚶、花蚶, 是一種棲息于沿海灘涂的廣溫性雙殼貝類。由于雙殼貝類自身用于代謝的混合氧化系統(tǒng)存在缺陷, 導致其體內(nèi)污染物的釋放較慢, 造成體內(nèi)保持較高的重金屬富集程度[23-24]。泥蚶不僅能富集重金屬, 且對重金屬有極強的耐受性。因此, 本文擬研究不同濃度重金屬Pb脅迫下泥蚶血液Vg、MT基因的表達規(guī)律, 有助于探索貝類的重金屬耐受及其抗氧化解毒機制,同時也是研究環(huán)境毒理學、生物健康及海岸保護的重要一環(huán)[25]。

1 　 材料與方法

1.1　實驗材料

實驗所用泥蚶由寧波甬盛水產(chǎn)種業(yè)有限公司提供, 在非繁殖期選取活力好、大小均一且外殼無損傷的2齡泥蚶, 殼長為(2.94±0.16)cm。

1.2　泥蚶攻毒實驗

實驗所用泥蚶在砂濾海水中暫養(yǎng)7 d, 水溫(21±1.0)℃, pH 為 8.1, DO>5 mg/L, NH4-N<0.05 mg/L, 持續(xù)充氣, 每日換水后投喂適量藻類。

將Pb(NO3)2配制成濃度為1.000 g/L 母液備用;根據(jù)《海水水質(zhì)標準》(GB 3097-1997), 海水養(yǎng)殖用水中Pb的限量值為5 μg/L。設置實驗組Pb2+濃度梯度為1、3、6、9 μg/L, 并以未添加Pb2+的自然海水作為對照組, 1 μg/L和3 μg/L為低于水質(zhì)標準的實驗濃度, 6 μg/L及9 μg/L為高于水質(zhì)標準的實驗濃度,各組均設三組平行。攻毒時間為28 d。

開始實驗前為消除容器對重金屬的吸附作用,先用等濃度Pb2+的實驗水體浸泡塑料箱24 h。此后,向每個塑料箱內(nèi)分別加入20 L實驗水體及40個泥蚶,實驗期間連續(xù)充氣, 每24 h換水1次, 并投喂扁藻。采樣在實驗開始的 0、7、14、21、28 d進行, 每箱取 4個泥蚶, 抽取血液于液氮中速凍后放于-80℃冰箱保存。

1.3　總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

用CWBIO的Trizol 總RNA 提取試劑, 提取所得泥蚶血液總RNA。再用TaKaRa PrimeScripttmRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)合成cDNA第一鏈, 用于泥蚶MT、Vg基因的熒光定量實驗。

1.4　泥蚶血液MT、Vg基因在不同濃度Pb2+脅迫下的表達規(guī)律研究

用 Primer Premier 5.0 軟件根據(jù)泥蚶MT、Vg的cDNA序列設計熒光定量引物, 以合成的 cDNA 第一鏈為模板對引物進行篩選。選擇無非特異性擴增和引物二聚體的引物, 最終獲得目的基因引物MT-real-F/MT-real-R、Vg-real-F/Vg-real-R(表 1), 根據(jù)chen的文章獲得泥蚶內(nèi)參基因引物Tg-β-actin-F、Tg-β-actin-R[20]。使用 ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR儀(ABI, USA)和 SYBR@Premix ExTMKit (TaKaRa,Japan)對不同濃度Pb2+脅迫下泥蚶血液 MT及Vg表達進行相對定量分析, 反應體系為 20 μL, 分別為2 μL 的 cDNA、引物各 1 μL、6 μL 的 ddH2O 和 10 μL的SYBR@PCR Mix。反應程序為: 預變性95℃ 15 min;95℃ 5 s, 60℃ 20 s, 72℃ 25 s, 40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束時, 進行溶解曲線分析, 每個樣品做3個平行。

表1　實驗所用到的qRT-PCR引物序列Tab. 1 The qRT-PCR primer sequences used in the experiment

1.5　數(shù)據(jù)分析

采用2–ΔΔCt法計算各處理組泥蚶MT、Vg的相對表達量。實驗數(shù)據(jù)采用 SigmaPlot13.0 Two Way ANOVA對各個組同時進行時間效應及濃度效應分析, P<0.05表示顯著差異, P<0.01表示極顯著差異。

2　結(jié)果

2.1　不同濃度 Pb2+脅迫下泥蚶血液 MT的表達規(guī)律

經(jīng)過28d的慢性攻毒實驗, 以β-actin為內(nèi)參基因, 以各時間點對照組泥蚶血液MT基因的表達量為基礎值1, 得到各個時間點其它濃度組 MT基因相對表達量, 結(jié)果如圖 1。

相同Pb濃度水平攻毒時間對泥蚶血液MT基因表達量的影響如下: 在1 μg/L Pb2+脅迫下, 泥蚶MT基因的相對表達量在14 d時達到最高值, 較7 d與28 d而言差異極顯著(P<0.01), 然后開始下降, 在28 d時表達回到最初水平。在3 μg/L Pb2+脅迫下, 其血液MT mRNA水平在14 d時到達最高值, 且與其他時間點相比差異極顯著(P<0.01); 隨著時間推移其表達情況整體呈現(xiàn)先上升后下降再上升的一種波動狀態(tài)。其他兩個濃度組, 泥蚶MT mRNA的表達水平基本上隨攻毒時間推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。不同的是, 6 μg/L實驗組其表達量在21d時達到最高值,與14 d時相比具有顯著性(P<0.05), 且較7 d與28 d而言差異極顯著(P<0.01); 而 9 μg/L實驗組在14 d時其 mRNA水平達到最高表達, 與其他時間點相比差異極顯著(P<0.01)。

相同攻毒時間下不同重金屬濃度對泥蚶血液MT基因表達的影響如下: 第7天, 各實驗組均無顯著差異。14 d時, 各濃度組泥蚶MT mRNA水平較對照組均顯著提高(P<0.01), 9 μg/L實驗組其表達水平最高。21 d時, 1、6及9 μg/L實驗組泥蚶MT mRNA水平較對照組均顯著提高(P<0.01), 且兩個高于水質(zhì)標準限值的實驗組其基因表達水平大于1 μg/L實驗組的表達水平。28 d時, 各實驗組泥蚶MT mRNA水平較對照組無顯著性差異。

上述結(jié)果表明, 在較長時間低劑量重金屬 Pb2+暴露下, 泥蚶血液MT mRNA水平與Pb2+濃度存在較好的正相關劑量效應; 另一方面, 各濃度組泥蚶血液MT mRNA水平隨時間推移基本上呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。

圖1　不同Pb2+濃度組泥蚶血液 MT基因相對表達量Fig. 1 Relative expression of MT gene in the blood of T.granosa under different concentrations of Pb2+

2.2　不同濃度Pb2+脅迫下泥蚶血液Vg表達規(guī)律

經(jīng)過28 d的Pb2+暴毒實驗, 泥蚶血液Vg mRNA的表達情況變化如圖2所示。相同Pb濃度水平攻毒時間對泥蚶血液Vg表達量的影響如下: 1 μg/L Pb2+脅迫下, 各時間點泥蚶血液Vg的表達較對照組均無顯著差異。3 μg/L Pb2+脅迫下, 其表達在14 d時被誘導達到最大值, 較其他時間點差異極顯著(P<0.01);在隨后的 21 d, 泥蚶血液 Vg的表達水平開始降低,但較對照組而言仍具顯著性(P<0.01), 到28 d時幾乎不表達; 總體上該濃度組泥蚶血液Vg的表達隨時間推移呈現(xiàn)先升后降的趨勢。6 μg/L Pb2+脅迫下, 各時間點泥蚶血液 Vg表達量與對照組相比均無明顯差異。9 μg/L Pb2+脅迫下, 泥蚶血液Vg基因表達水平在前21 d均無顯著變化, 但到 28 d時被顯著誘導達到較高表達水平, 較其他各時間點均差異顯著(P<0.01)。

圖2　不同Pb2+濃度組泥蚶血液Vg基因相對表達量Fig. 2 Relative expression of Vg gene in the blood of T.granosa under different concentrations of Pb2+

相同攻毒時間下不同Pb濃度對泥蚶血液Vg表達量的影響如下: 在 7 d時, 各濃度組泥蚶血液 Vg的表達量較對照組均無顯著差異; 14 d時, 僅3 μg/L實驗組泥蚶血液Vg的表達較同時期對照組而言顯著上升(P<0.01); 21 d時, 同樣僅3 μg/L實驗組泥蚶血液Vg較同期對照組顯著表達(P<0.01); 28 d時, 除9 μg/L實驗組泥蚶血液 Vg表達顯著上升外(P<0.01), 其他濃度實驗組較同時期對照組均無顯著變化。通過較長時期低劑量重金屬暴露下泥蚶血液 Vg表達量比較可知, 3 μg/L Pb2+濃度對其誘導表達的效果最為顯著。

3　討論

近年來, 環(huán)境中重金屬污染的日益嚴重, 引發(fā)了關于重金屬對水產(chǎn)生物抗氧化相關基因或蛋白的“研究熱”。包永波等通過對蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)氧化應激蛋白、鈣結(jié)合蛋白和硫代謝相關蛋白是泥蚶應對重金屬鎘脅迫的關鍵蛋白[26]。但目前關于Pb脅迫下生物體內(nèi)的免疫防御機制并不清晰。僅有少數(shù)研究表明Pb能減弱小鼠[27]、長牡蠣[28]的抗氧化能力。因此在Pb污染日益嚴重的當下, 探究機體對Pb刺激的應答具有重要意義。

MT活性結(jié)構(gòu)中的金屬離子能在體內(nèi)釋放作為抗氧化的促進劑, 并暴露出半胱氨酸殘基中的巰基與氧自由基發(fā)生反應[29]。此外, MT可螯合機體內(nèi)部的金屬離子, 參與體內(nèi)金屬離子代謝, 調(diào)節(jié)金屬離子穩(wěn)態(tài), 防止及修復由于金屬離子失衡對機體造成的氧化損傷[30]。任玉娟等發(fā)現(xiàn)不同濃度的Cd(0.5、5、50 mg/L)脅迫下, 無齒蚌MT基因的表達量均在14d顯著上調(diào)[5]。Khati等[31]將翡翠貽貝在200 μg/LCd2+脅迫7 d后, 發(fā)現(xiàn)實驗組MTs相較對照組而言更高。本實驗發(fā)現(xiàn)泥蚶在各濃度 Pb2+脅迫下 MT基因表達量在14 d顯著上調(diào), 表明MT對重金屬Pb的作用與Cd相似, 只有機體中的Pb2+積累到一定程度時, MT才會被顯著誘導。但在暴毒 14 d后, 相對表達量開始下降, 且在28 d時回落到7 d的水平, 隨時間的推移整體呈現(xiàn)先增后減的趨勢。周湖明等[9]在對近江牡蠣進行慢性Pb攻毒實驗中, 發(fā)現(xiàn)MT表達量呈先增后減的模式。霍禮輝等[11]在對縊蟶研究中也發(fā)現(xiàn), 其內(nèi)臟團MT表達呈現(xiàn)脈沖式波動, 具有較強的時間依賴性。說明Pb2+刺激能誘導MT基因表達, 合成大量的MT與Pb2+結(jié)合, 當MT含量太高時又會對自身的轉(zhuǎn)錄機制產(chǎn)生負反饋抑制其表達[32-34]。同時 MT參與機體新陳代謝, 會在相關酶的作用下被降解[35],故呈現(xiàn)先上升在下降的趨勢。

Vg具有一定的免疫防御功能, 可以通過與金屬離子結(jié)合、清除體內(nèi)自由基等方式來發(fā)揮其抗氧化作用[36-38]。顧海龍等[39]發(fā)現(xiàn)在Cd脅迫下, 泥蚶消化腺 Vg被顯著誘導表達, 并維持在較高水平; 吳林德等[21]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過 1、3、6 μg/L 的 Pb脅迫 28 d后, 泥蚶內(nèi)臟團Vg的相對表達呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在本實驗中, 泥蚶血液Vg基因表達量隨暴毒時間的延長, 3 μg/L和9 μg/L濃度組其被顯著誘導表達, 且在暴毒14 d后, 3 μg/L濃度組的相對表達量總體也呈現(xiàn)先增后減的趨勢。Corona等[40]發(fā)現(xiàn)蜂王在其腹脂肪體合成Vg蛋白作為抗氧化劑, 有助于延長蜂王的壽命。Hiramatsu等[41]研究發(fā)現(xiàn)華貴櫛孔扇貝Vg是一種強效的免疫保護蛋白, 具有氧化活性。

綜上所述, 推測是由于Pb脅迫引起了泥蚶體內(nèi)的氧化應激反應, 產(chǎn)生了大量 ROS, 機體通過誘導Vg等基因的表達, 清除自由基, 從而緩解氧化壓力,防止ROS對機體造成損傷。通過兩個基因表達趨勢的比較發(fā)現(xiàn), 在28 d時, 各濃度組泥蚶血液MT基因表達均處于較低水平, 而此時泥蚶血液Vg基因顯著表達, 猜測兩者之間存在一定協(xié)調(diào)互補關系。而在低濃度長時間Pb2+暴毒下, 泥蚶血液MT基因的敏感性要優(yōu)于泥蚶血液 Vg基因。綜上可見, 從泥蚶血液MT和 Vg基因的表達情況來看, 兩者均不同程度地參與貝類重金屬解毒。但其具體的誘導機制和解毒機理及相互關系還有待探究。

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