聶鴻濤, 盧長(zhǎng)煒, 柴成林, 楊 鳳, 閆喜武

(大連海洋大學(xué), 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)隸屬軟體動(dòng)物門、簾蛤目、簾蛤科、蛤仔屬, 是重要海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類, 廣泛分布于我國(guó)南北海區(qū)。然而, 近年來(lái)蛤仔養(yǎng)殖存在因品種單一、苗種自給率低、良種率低、缺少高產(chǎn)抗逆優(yōu)良品種等問(wèn)題, 因此進(jìn)行良種選育十分必要[1]?！鞍唏R蛤”是通過(guò)群體累代人工定向選育培育而成的我國(guó)第一個(gè)新品種, 具有殼色美觀[2]、耐低溫[3]、耐低鹽[4]和存活率高[5]等優(yōu)點(diǎn)。

大多數(shù)棲息在潮間帶的無(wú)脊椎動(dòng)物, 經(jīng)常面臨低氧環(huán)境, 抑制代謝率是低氧耐受最重要的適應(yīng)之一[6-10]。生活在潮間帶的海洋貝類容易受到缺氧環(huán)境的影響。目前關(guān)于貝類對(duì)低氧的生理反應(yīng)已有許多研究報(bào)道, 主要包括組織行為、生理生化等不同水平的缺氧影響[11-13], 表現(xiàn)出可逆的蛋白磷酸化, 以限制缺氧期間許多酶和功能蛋白的活性[14]。在貝類養(yǎng)殖過(guò)程中, 夏季經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)低氧環(huán)境, 尤其池塘中嚴(yán)重低氧, 明顯制約貝類的生長(zhǎng)和存活[15-18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定不同低氧水平下菲律賓蛤仔抗氧化酶的變化, 研究其耐受能力, 旨在為蛤仔養(yǎng)殖提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的菲律賓蛤仔為大連莊河養(yǎng)殖群體,共 300個(gè)個(gè)體。實(shí)驗(yàn)所用海水為黑石礁海區(qū), 經(jīng)沉淀、砂濾后儲(chǔ)存?zhèn)溆盟?。?shí)驗(yàn)開始前, 先將蛤仔暫養(yǎng)3 d, 暫養(yǎng)期間不投喂, 水溫12℃±0.3℃, 每天換水1次。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一都用水質(zhì)分析儀來(lái)測(cè)定海水的鹽度和pH, 實(shí)驗(yàn)所用海水pH8.0, 鹽度32。挑選100個(gè)大小相近的蛤仔, 分別放在4個(gè)30 L暫養(yǎng)缸里, 溶解氧DO分別為2.0 mg/L和7.0 mg/L, 0.5 mg/L和7.0 mg/L。低氧控制方法為固定充氮設(shè)備, 充氮的同時(shí)將水質(zhì)分析儀探頭伸入暫養(yǎng)缸測(cè)溶解氧 DO的變化。當(dāng)溶解氧DO快到達(dá)所需濃度時(shí), 停止充氮。等待5 min再測(cè) DO, 低于所需濃度時(shí)充點(diǎn)氧氣; 高于所需濃度時(shí)再充點(diǎn)氮?dú)狻Ｆ渌?個(gè)缸為重復(fù)。每隔3 h測(cè)1次DO, 保證 DO水平偏離目標(biāo)低氧水平太多, 要及時(shí)充氮或充氧。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

取蛤仔的鰓和消化腺裝進(jìn)凍存管放入液氮保存。解剖完畢后做好標(biāo)記裝進(jìn)密封袋再統(tǒng)一放進(jìn)–80℃冷凍冰箱保存, 用酶標(biāo)儀測(cè)定乳酸脫氫酶 LDH、琥珀酸脫氫酶SDH、堿性磷酸酶AKP。

1.3　數(shù)據(jù)處理

計(jì)算公式:酶活性(U/g)=測(cè)定OD值–對(duì)照OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值–

空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(2mmol/L)/

勻漿蛋白濃度(g/mL)

結(jié)果分析比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析, 用 SPSS20.0處理數(shù)據(jù), 差異顯著性設(shè)置為P<0.05。

2　結(jié)果

在低氧(0.5 mg/L)和對(duì)照組中, 隨著時(shí)間的延長(zhǎng),消化腺和鰓中琥珀酸脫氫酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖1),消化腺琥珀酸脫氫酶活力高于鰓, 低氧脅迫組的消化腺中琥珀酸脫氫酶活力高于對(duì)照組, 在對(duì)照組消化腺中琥珀酸脫氫酶活力也高于鰓(圖1)。

圖1　琥珀酸脫氫酶在低氧(0.5 mg/L)和對(duì)照組比較Fig. 1 SDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5 mg/L)

琥珀酸脫氫酶在低氧(2.0 mg/L)時(shí)和對(duì)照組比較見圖 2, 琥珀酸脫氫酶含量上下波動(dòng)不大, 僅有對(duì)照組消化腺在第5 天和第8 天波動(dòng)較大(圖2)。

圖2　琥珀酸脫氫酶在低氧(2.0 mg/L)和對(duì)照組比較Fig. 2 SDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (2.0 mg/L)

隨低氧(0.5 mg/L)脅迫時(shí)間延長(zhǎng), AKP酶活力在低氧水平呈不規(guī)律變化(圖3)。消化腺中堿性磷酸酶含量比鰓含量多, 處理組、對(duì)照組中堿性磷酸酶在消化腺和鰓含量相差不大。低氧水平對(duì)琥珀酸脫氫酶活力影響都不顯著(P>0.05)。

圖3　堿性磷酸酶在低氧(0.5 mg/L)和對(duì)照組比較Fig. 3 AKP activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5mg/L)

隨低氧(2.0 mg/L)脅迫時(shí)間延長(zhǎng), 消化腺中AKP呈先升高后降低趨勢(shì), 對(duì)堿性磷酸酶活力影響較大,在低氧脅迫第5 天消化腺中AKP酶含量高于鰓。處理組和對(duì)照組中堿性磷酸酶的含量相差不大, 低氧脅迫組消化腺和鰓中的酶活力高于對(duì)照組(圖4)。

圖4　堿性磷酸酶在低氧(2.0 mg/L)和對(duì)照組比較Fig. 4 AKP activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (2.0mg/L)

從整體可以看出隨著時(shí)間的延續(xù), 同一部位乳酸脫氫酶活力在逐漸降低。對(duì)照組消化腺中乳酸脫氫酶活力略高于低氧脅迫組, 低氧脅迫下鰓中乳酸脫氫酶活力高于對(duì)照組, 消化腺中乳酸脫氫酶活力高于鰓(圖5)。

如圖 6所示, 消化腺中的乳酸脫氫酶活力呈一個(gè)上升趨勢(shì), 對(duì)照組中的酶活力較處理組相比更強(qiáng),而鰓中酶活力呈現(xiàn)不規(guī)律變化(圖6)。

圖5　乳酸脫氫酶在低氧(0.5 mg/L)和對(duì)照組比較Fig. 5 LDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5mg/L)

圖6　乳酸脫氫酶在低氧(2.0 mg/L)和對(duì)照組比較Fig. 6 LDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (2.0mg/L)

圖7　琥珀酸脫氫酶在低氧(0.5 mg/L和2.0 mg/L)與對(duì)照組比較Fig. 7 SDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5 mg/L and 2.0mg/L)

琥珀酸脫氫酶活力在兩個(gè)低氧水平(0.5 mg/L和2.0 mg/L)脅迫下總體上是呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖7)。處理組和對(duì)照組比較, 處于低氧脅迫下的菲律賓蛤仔琥珀酸脫氫酶活力略高, 說(shuō)明蛤仔需要這種酶來(lái)協(xié)助極限低氧環(huán)境下, 自己的正常呼吸; 可以得出低氧脅迫抑制了琥珀酸脫氫酶活力。低氧組DO(0.5 mg/L)在第 8 天對(duì)琥珀酸脫氫酶活力影響顯著(P<0.05),在 0、第 2 天、第 5 天均不顯著(P>0.05), 低氧組DO(2.0 mg/L)時(shí)在第2 天、第8 天對(duì)琥珀酸脫氫酶活力影響顯著(P<0.05)。

對(duì)比兩個(gè)不同低氧水平DO (0.5 mg/L和2.0 mg/L),堿性磷酸酶總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖 8), 說(shuō)明在低氧脅迫下, AKP活力升高, 低氧(0.5 mg/L)下的酶活力略高于低氧(2.0 mg/L), 處理組的酶活力基本都高于對(duì)照組酶活力。溶氧DO(0.5 mg/L)時(shí)在0、第2天、第5天、第8天對(duì)堿性磷酸酶活力影響都顯著; 溶氧DO(2.0 mg/L)時(shí)在第2天、第5天、第8天對(duì)琥珀酸脫氫酶活力影響顯著(P<0.05)。

圖 8 堿性磷酸酶在低氧(0.5mg/L)和低氧(2.0mg/L)與對(duì)照組的比較Fig. 8 AKP activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5 mg/L and 2.0mg/L)

對(duì)比兩個(gè)低氧水平DO (0.5 mg/L和2.0 mg/L),低氧脅迫抑制了乳酸脫氫酶活力(圖9)。在較低溶氧下, 乳酸脫氫酶活力高, 說(shuō)明乳酸脫氫酶參與了適應(yīng)低氧環(huán)境; 通過(guò)比較處理組和對(duì)照組可以看出,對(duì)照組 LDH酶活力高, 說(shuō)明在低氧脅迫下, 蛤仔LDH酶活力受到抑制, 活力較弱。溶氧DO(0.5 mg/L)時(shí)在第 2天對(duì)乳酸脫氫酶活力影響都顯著(P<0.05);溶氧DO(2.0 mg/L)時(shí)在第2 天、第5 天、第8 天對(duì)乳酸脫氫酶活力影響顯著(P<0.05)。

圖9　乳酸脫氫酶在低氧(0.5 mg/L和2.0 mg/L)與對(duì)照組比較Fig. 9 LDH activity in Ruditapes philippinarum under hypoxia stress (0.5 mg/L and 2.0mg/L)

3　討論

琥珀酸脫氫酶在溶氧水平 DO(0.5 mg/L)時(shí)在低氧環(huán)境下, 菲律賓蛤仔為了維持自身生存, 產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶SDH的組織活動(dòng)不活躍, 導(dǎo)致合成琥珀酸脫氫酶受到抑制作用。對(duì)照組消化腺和鰓中琥珀酸脫氫酶活力較低, 是因?yàn)樵谘鯕獬渥愕沫h(huán)境下,蛤仔新陳代謝較旺盛, 需要的量也就越多, 琥珀酸脫氫酶活力高。在低氧水平(2.0 mg/L)時(shí), 琥珀酸脫氫酶活力較穩(wěn)定。在低氧環(huán)境下能夠促進(jìn)堿性磷酸酶產(chǎn)生, 菲律賓蛤仔的消化腺主要用來(lái)分泌消化酶分解食物, 在低氧脅迫下乳酸脫氫酶活力升高; 而對(duì)照組的消化腺酶活力高于處理組消化腺酶活力是因?yàn)殚L(zhǎng)期低氧抑制了酶的活性, 使酶活力反而下降;低氧脅迫組鰓的酶活力高于對(duì)照組鰓酶活力道理類似, 在低氧脅迫下, 低氧處理組需要更多地能量用于呼吸作用, 因此酶活力也就越大[19]。Chen等[20]的研究表明, 櫛孔扇貝的血細(xì)胞總數(shù)隨溶氧濃度的降低而逐漸減少, 并且在溶氧降至 2.5 mg/L時(shí)下降46%, 顯著低于對(duì)照組。David等[11]在牡蠣低氧脅迫研究中發(fā)現(xiàn), 低氧脅迫會(huì)影響牡蠣的先天性免疫系統(tǒng), 從而導(dǎo)致死亡率升高。

低氧環(huán)境下, 溶氧水平較低能夠促進(jìn)堿性磷酸酶產(chǎn)生, 處于低氧脅迫下的菲律賓蛤仔琥珀酸脫氫酶活力先升高后降低, 說(shuō)明蛤仔需要這種酶來(lái)協(xié)助極限低氧環(huán)境下自身的正常呼吸, 但長(zhǎng)期低氧脅迫或極端低氧條件下抑制了琥珀酸脫氫酶活力。兩個(gè)低氧水平(0.5 mg/L和2.0 mg/L)處理組比較, 酶活力相差較大, 說(shuō)明不同低氧程度對(duì)蛤仔酶活力的影響有所差異[21]。蛤仔在低氧脅迫下第5 天和第8 天酶活力差異不明顯, 說(shuō)明逐步適應(yīng)了低氧環(huán)境[22]。從處理組和對(duì)照組可以看出, 消化腺中的乳酸脫氫酶活力呈上升趨勢(shì), 對(duì)照組中的酶活力較處理組相比更高, 而鰓中酶活力忽高忽低。原因可能是低氧脅迫抑制了乳酸脫氫酶活力, 所以對(duì)照組消化腺活力高于處理組。處理組和對(duì)照組消化腺中酶活力都高于鰓中乳酸脫氫酶活力, 原因可能是消化腺新陳代謝更旺盛, 酶活力相對(duì)更高。溶氧水平為2.0 mg/L的低氧脅迫抑制了菲律賓蛤仔乳酸脫氫酶活力[23]。而兩種低氧水平(0.5 mg/L和2.0 mg/L)比較發(fā)現(xiàn), 在極端低氧條件下, 菲律賓蛤仔乳酸脫氫酶活力反而升高, 說(shuō)明乳酸脫氫酶參與了蛤仔機(jī)體抵御極端低氧引起的不適, 并通過(guò)生理生化指標(biāo)改變以適應(yīng)低氧環(huán)境[24,25]。通過(guò)低氧脅迫處理組和對(duì)照組比較可以看出, 對(duì)照組酶活力高, 說(shuō)明在低氧脅迫下, 蛤仔酶活力受到抑制, 活力降低[26]。

綜上, 本實(shí)驗(yàn)研究了兩種低氧脅迫(0.5 mg/L和2 mg/L)對(duì)菲律賓蛤仔抗氧化酶的影響。在低氧脅迫時(shí)間越長(zhǎng)的條件下, 乳酸脫氫和琥珀酸脫氫酶活力逐漸降低, 而堿性磷酸酶活力逐漸升高, 兩種低氧水平蛤仔的抗氧化酶表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。研究結(jié)果為菲律賓蛤仔在低氧生理生態(tài)學(xué)奠定了基礎(chǔ),為蛤仔人工養(yǎng)殖提供了參考。

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