楊麗娜，徐 琳，高玉濤

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 ，云南 昆明 650032）

血漿ctDNA在卵巢上皮惡性腫瘤的早起診斷與療效研究

楊麗娜，徐 琳，高玉濤

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 ，云南 昆明 650032）

卵巢上皮性癌是常見的婦科惡性腫瘤，早期診斷非常困難，70%以上的患者就診時(shí)已屬晚期，5年生存率滯留在30%左右。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)卵巢癌的預(yù)后至關(guān)重要。卵巢癌的早期診斷、療效評(píng)估多依靠腫瘤標(biāo)志物，但敏感性和特異性均不夠理想。故尋求理想的標(biāo)記物早期診斷、評(píng)估化療的敏感性，對(duì)提高臨床療效具有重要意義。ctDNA是腫瘤細(xì)胞脫落或凋亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的DNA片段。有文獻(xiàn)證明在腫瘤患者中ctDNA可以被定性、定量和追蹤，可以用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療評(píng)估。

血漿ctDNA；腫瘤；卵巢癌；早期診斷；療效評(píng)價(jià)

血漿游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）是外周血中游離存在、不包含在完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的DNA。循環(huán)系統(tǒng)中存在cfDNA早已得到證實(shí)。目前，cfDNA可能來源于以下三種情況：①來自于細(xì)胞的凋亡進(jìn)程中片段化的DNA；②來自于壞死的細(xì)胞的DNA碎片；③來自于細(xì)胞分泌的exosome。其中，cfDNA主要來源于細(xì)胞凋亡。而國(guó)內(nèi)ctDNA 在婦科惡性腫瘤中的相關(guān)研究極少。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比腫瘤組織及外周血ctDNA基因突變，評(píng)估早期診斷的可行性，提高卵巢癌早期檢測(cè)的靈敏度、特異性。并對(duì)治療前后患者外周血ctDNA變化情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，探尋一種可以預(yù)測(cè)治療效果的方法[1-2]。對(duì)于早期診斷卵巢癌，選擇最佳的、個(gè)性化的治療方案及判斷預(yù)后有非常重要的價(jià)值。

1 立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容

項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)，研究意義、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析，需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢(shì)來論述科學(xué)意義；或結(jié)合國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中迫切需要解決的關(guān)鍵科技問題來論述其應(yīng)用前景。卵巢上皮性癌是常見的婦科惡性腫瘤，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤的首位。早期缺乏特異性的腹盆腔癥狀和敏感標(biāo)記物使得卵巢癌的早期診斷非常困難，70%以上的患者就診時(shí)已屬晚期，其5 年生存率仍然滯留在30%左右。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是卵巢癌治療的關(guān)鍵。卵巢癌的早期診斷、療效評(píng)估多依靠腫瘤標(biāo)志物，如CA125和HE4，但現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物敏感性和特異性均不夠理想。故尋求理想的腫瘤標(biāo)記物早期診斷并有效地預(yù)估卵巢癌對(duì)化療的敏感性，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化方案，對(duì)提高臨床療效頗具意義。ctDNA（Circulating tumor DNA），是原發(fā)腫瘤甚至是轉(zhuǎn)移形成的新腫瘤上的細(xì)胞脫落或者當(dāng)細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的DNA 片段。在腫瘤形成早期，血液中已經(jīng)開始有ctDNA 了，有多篇文獻(xiàn)證明在多種腫瘤患者中ctDNA可以被定性、定量和追蹤，可以用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和治療評(píng)估。2015 年發(fā)表于《Nature Communications》雜志的一項(xiàng)新的研究，Mark Sausen 等[3]首次發(fā)現(xiàn)，流進(jìn)入血液中的腫瘤DNA，可用于實(shí)時(shí)跟蹤胰腺癌的發(fā)展以及對(duì)治療的反應(yīng)。在非小細(xì)胞肺癌方面，ctDNA 研究頗多，如有學(xué)者研究[4]顯示ctDNA 濃度水平可真實(shí)反映經(jīng)不同手段治療的早期或晚期非小細(xì)胞肺癌腫瘤負(fù)荷變化。ctDNA 有望成為惡性腫瘤早期診斷和療效判斷的新型腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)志物。在諸多腫瘤ctDNA 研究方面，ctDNA 在卵巢癌方面的研究國(guó)外報(bào)道較少，如有學(xué)者研究[5]顯示ctDNA 在7 例III 期卵巢癌患者的血漿中均可檢測(cè)到。而目前國(guó)內(nèi)ctDNA 在卵巢癌方面的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。卵巢上皮癌死亡率在婦科腫瘤中占第一位，為降低卵巢癌的死亡率，改善卵巢癌患者的預(yù)后，迫切需要積累更多相關(guān)數(shù)據(jù)來明確ctDNA 在卵巢癌早篩、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)以及化療耐藥甚至靶向治療方面的作用和價(jià)值。

2 研究?jī)?nèi)容

2.1 明確ctDNA 在卵巢癌的早期診斷方面的價(jià)值；

2.2 卵巢上皮性癌患者術(shù)前、術(shù)后、化療過程中、化療后、隨訪中、復(fù)發(fā)時(shí)等不同時(shí)間點(diǎn)ctDNA 含量的變化；

2.3 ctDNA 含量與卵巢癌手術(shù)病理分期、腫瘤大小、腫瘤級(jí)別等臨床病理參數(shù)之的相關(guān)性；

2.4 ctDNA 含量與化療效果及腫瘤預(yù)后的相關(guān)性；

2.5 ctDNA 水平和腫瘤大小(用超聲和CT 評(píng)估) 之間的相關(guān)性；

2.6 ctDNA 預(yù)測(cè)上皮性卵巢癌復(fù)發(fā)的敏感性和特異性；

2.7 對(duì)腫瘤組織和血液樣本進(jìn)行基因篩查和對(duì)比，確定卵巢癌的基因型；

3 研究方法

卵巢癌患者ctDNA 檢測(cè)樣本的獲取：卵巢癌患者術(shù)前、術(shù)后、化療過程中、化療后、復(fù)發(fā)時(shí)的血樣均于清晨空腹時(shí)抽取肘靜脈血10ml 于EDTA 抗凝管中，并在30 分鐘至 2 h 內(nèi)做以下 2 步處理：

1）在4℃條件下1800 g 離心 10 min，離心后將上清（血漿）分裝到多個(gè) 2.0 ml 的離心管中。下層血細(xì)胞分裝到 2 ml 凍存管中，即為所需血細(xì)胞；

2）在4℃條件下以 16000 g 離心 10 min 去除殘余細(xì)胞，將上清轉(zhuǎn)入新的 2.0 ml 的離心管中，即得到所需的血漿。而后將樣品保存到-80℃冰箱中或干冰中待測(cè)定。

4 本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處

4.1 通過定性、定量和追蹤ctDNA，探索通過ctDNA 進(jìn)行卵巢癌早期診斷及療效評(píng)價(jià)的可能機(jī)制。

4.2 癌癥個(gè)體化深度測(cè)序分析方法是目前液態(tài)檢測(cè)的一種新方法，其在卵巢癌中的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

4.3 目前腫瘤治療已經(jīng)進(jìn)入靶向治療的新時(shí)期，卵巢癌Brca 基因突變靶向治療初現(xiàn)端倪，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ctDNA 檢測(cè)腫瘤的突變位點(diǎn)，尋找新的靶向治療位點(diǎn)的可能。

5 總 結(jié)

ctDNA，ctDNA中檢測(cè)出的基因變異（EGFR或者ALK）是否可以直接指導(dǎo)臨床治療，我們需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)來證實(shí)；EGFR突變患者使用靶向治療耐藥的過程中，RECIST標(biāo)準(zhǔn)往往評(píng)價(jià)不夠完整，如何通過血液監(jiān)測(cè)耐藥突變（T790M）的豐度來指導(dǎo)我們的耐藥，也非常值得臨床探索。在將來，隨著我們檢測(cè)方法的不斷進(jìn)步，期待液態(tài)活檢技術(shù)能夠真正應(yīng)用到臨床，指導(dǎo)肺瘤精準(zhǔn)治療，成為延長(zhǎng)患者生存期的必備手段！

[1] Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M, et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitormetastatic breast cancer. N Engl J Med.2013;368:1199–1209.

[2] Garcia-Murillas I, Schiavon G, Weigelt B, Ng C, Hrebien S, Cutts RJ, Cheang M, Osin P,Nerurkar A, Kozarewa I et al: Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in earlybreast cancer. Sci Transl Med 2015, 7(302):302ra133.

[3] Sausen M, Phallen J, Adleff V, et al. Clinical implications of genomic alterations in the tumourand circulation of pancreatic cancer patients. Nature communications. 2015;6:7686.

[4] 高玉濤,吳令英,張 偉,等.三磷酸腺苷-腫瘤體外藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)復(fù)發(fā)性卵巢上皮性癌化療的前瞻性研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2013,48(5):358-363.

[5] 徐 琳,王 艷,韓雪松,等.超聲消融治療大于45 歲子宮肌瘤患者后性激素變化分析[J]. 云南醫(yī)藥,2016,(02):172-175.

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ISSN.2095-8803.2017.24.075.02