陳勇治，舒健，王俊，呂品，張紅輝

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院/ 湖南省人民醫(yī)院 膽道外科，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）為我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，預(yù)后差。盡管近年來(lái)醫(yī)學(xué)水平不斷提升，但HCC患者遠(yuǎn)期生存率仍遠(yuǎn)不及50%[1-2]。多數(shù)患者確診時(shí)多已處于中、晚期。因此發(fā)現(xiàn)有效的分子生物學(xué)診斷指標(biāo)，做到早期診斷與治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。microRNA分子是一類(lèi)非編碼小RNA，具有高度保守性，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。let-7a作為microRNA分子一員，可通過(guò)與c-Myc[3]、HMGA2[4]和RAS[5]等癌基因的3′非編碼翻譯區(qū)結(jié)合從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程。已有研究[6]表明，let-7a表達(dá)在HCC中明顯下調(diào)，與HCC的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，有望成為潛在診斷與靶向治療的分子指標(biāo)。報(bào)道[7]顯示，不同疾病狀態(tài)下患者血清/血漿miRNA存在差異表達(dá)，且具有穩(wěn)定性與組織特異性，這讓腫瘤患者血清異常表達(dá)的miRNA成新的分子診斷標(biāo)志物成為可能。關(guān)于let-7a在血液中表達(dá)水平與HCC的關(guān)系如何？本研究采取qRT-PCR測(cè)定HCC患者血清let-7a水平，探討let-7a與HCC患者臨床病理因素的關(guān)系，并進(jìn)一步分析其對(duì)于HCC的診斷效能，為尋找新的HCC分子診斷指標(biāo)提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

選擇2015年8月—2017年1月于湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)治療的60例HCC患者作為觀察組，所有患者均于術(shù)后病理確診為HCC，包括女17例，男43例；年齡37～68歲，平均（55.7±14.6）歲。根據(jù)相關(guān)指南[8]進(jìn)行腫瘤的TNM分期：其中39例患者為I～I(xiàn)I期，21例為III～I(xiàn)V期。選擇我院體檢科46例正常人血清標(biāo)本為正常對(duì)照組，包括女13例，男33例；年齡34～65歲，平均（53.4±13.1）歲。本研究所有患者均知情同意，并簽署了知情同意書(shū)，獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2　觀察指標(biāo)

收集患者完整病例資料，包括性別、年齡、HBV感染情況、合并肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤個(gè)數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、病理分級(jí)、AFP水平、癌栓形成情況。其中病理分級(jí)根據(jù)術(shù)后病理切片肝癌細(xì)胞分化程度分為高、中、低級(jí)。癌栓形成的診斷為術(shù)前經(jīng)B超、增強(qiáng)CT等影像學(xué)資料發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)癌栓形成，經(jīng)術(shù)后病理確診。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷經(jīng)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝門(mén)、腹膜后等部位淋巴結(jié)的存在，術(shù)后經(jīng)病理確診。

1.3　主要試劑

RNA提取試劑盒來(lái)自北京中杉金橋公司。miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)自北京康為世紀(jì)生物公司。SYBR Green熒光定量PCR試劑盒來(lái)自美國(guó)的Invitrogen公司。let-7a及內(nèi)參U6來(lái)自美國(guó)Proteintech公司。熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Forma公司。

1.4　實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1血清樣本的收集選擇無(wú)RNA酶管收集參與研究對(duì)象4 mL血液標(biāo)本，常溫條件靜置1～1.5 h直到標(biāo)本全部凝固。接著予以在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行10 min的離心，予以吸取1.5 mL上清液置入無(wú)RNA酶離心管里面，在-80 ℃條件進(jìn)行保存?zhèn)浜罄m(xù)使用，全部標(biāo)本保存時(shí)間不超過(guò)2個(gè)月。

1.4.2逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)開(kāi)展操作。予以建立相應(yīng)反應(yīng)體系，其終體積為20 μL：dNTP mix（100 mmol/L）0.2 μL，Multiscribe 逆轉(zhuǎn) 錄 酶（50 U/μL）1.0 μL，10× 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，RNA 酶抑制劑（20 U/μL）1 μL，RNase-free水 9.8 μL，混合逆轉(zhuǎn)引物 1 μL 引物，5 μL RNA。予以將上述反應(yīng)體系輕輕混合均勻，進(jìn)行較短暫的離心后予以至于冰塊上。RT-PCR反應(yīng)條件：16 ℃，30 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min；4 ℃保存。

1.4.3qRT-PCR檢測(cè)miRNAs let-7a的表達(dá)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。予以建立相應(yīng)反應(yīng)體系，其終體積為20 μL：2×SYBR Green熒光定量預(yù)混液10 μL，引物1 μL，前述擴(kuò)增好的cDNA（1:20稀釋）2 μL，去核酸酶水 7.0 μL。通過(guò)RocheLightCyeler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)參數(shù)：95℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，45 s共40個(gè)循環(huán)。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

選擇SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊性者采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較選擇t檢驗(yàn)，多組間比較選擇方差分析；計(jì)數(shù)資料選擇χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法；采用受試者工作曲線（ROC）比較let-7a及聯(lián)合AFP對(duì)HCC的診斷價(jià)值；按α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　HCC患者血清let-7a的表達(dá)

采用RT-qPCR檢測(cè)let-7a的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示let-7a在觀察組、對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量分別為：0.538±0.106、1.571±0.128，兩組間表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2　血清Let-7a的表達(dá)與HCC臨床病理因素的關(guān)系

HCC患者血清let-7a相對(duì)表達(dá)量與癌栓形成有關(guān)（P＜0.05）；與性別、年齡、HBV感染、肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤個(gè)數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分級(jí)、AFP水平無(wú)關(guān)（P＞0.05）（表1）。

圖1　HCC患者及健康者血清let-7a水平比較Figure 1　Comparison of let-7a levels between HCC patients and healthy subjects

表1　HCC患者血清let-7a相對(duì)表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）Table 1　Relations of serum let-7a level with pathologic factors in HCC patients (±s)

表1　HCC患者血清let-7a相對(duì)表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）Table 1　Relations of serum let-7a level with pathologic factors in HCC patients (±s)

因素　n　l e t-7 a表達(dá)量　t　P性別男43　0.56±0.103　0.997　0.323女17　0.53±0.110年齡（歲）≤55　36　0.51±0.109　1.710　0.093＞55　24　0.56±0.114 H B V（+）　47　0.51±0.093　1.316　0.193（-）　13　0.55±0.111腫瘤直徑（c m）＜3　8　0.54±0.122　0.553　0.583≥3　52　0.52±0.091腫瘤個(gè)數(shù)單發(fā)　38　0.53±0.100　1.316　0.194多發(fā)　22　0.57±0.134肝硬化有56　0.53±0.097　0.787　0.434無(wú)4　0.57±0.118 T N M分期I+I I　41　0.55±0.101　1.018　0.313 I I I+I V　19　0.52±0.117淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)46　0.56±0.096　0.970　0.336有14　0.53±0.118癌栓形成無(wú)38　0.60±0.112　3.889　0.000有22　0.481±0.118 A F P（p g/L）≤20　23　0.52±0.107　0.372　0.175＞20　37　0.56±0.113病理分級(jí)高14　0.54±0.1160.704　0.577中31　0.53±0.102低15　0.51±0.114

2.3　let-7a及l(fā)et-7a聯(lián)合AFP對(duì)HCC的診斷效能

以0.529為let-7a的相對(duì)表達(dá)量的最佳臨界值診斷HCC，其靈敏度為79%，特異度為71%，曲線下面積（AUC）為0.77（95% CI=0.624～0.839）。血清A F P診斷H C C靈敏度為75%，特異度為96%，AUC為0.84（95% CI=0.751～0.931）；聯(lián)合檢測(cè)血清let-7a與AFP診斷HCC，靈敏度為83%，特異性為97%，AUC為0.92（95% CI=0.866～0.987）（圖2）。

圖2　血清let-7a及AFP診斷HCC的ROC曲線Figure 2　ROC curves of serum let-7a and AFP for diagnosis of HCC

3　討　論

腫瘤的早期診斷與治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。然而，目前臨床上大部分腫瘤均缺少特異性與敏感性均很高的理想分子標(biāo)志，探索腫瘤發(fā)生早期的可靠標(biāo)志物是目前臨床與科研中一大熱點(diǎn)。外周血分子標(biāo)志物的測(cè)定具有創(chuàng)傷極小，操作簡(jiǎn)便，可反復(fù)多次進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，是較為理想的診斷手段[9]。

近年來(lái)腫瘤相關(guān)血清/血漿游離核酸作為分子標(biāo)志物的研究日益受到學(xué)者們的重視。隨著腫瘤不斷的增長(zhǎng)其組織常存在局部缺血，表面破潰等情況，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡壞死等，破壞的細(xì)胞內(nèi)所釋放的核酸則會(huì)入血，進(jìn)而引起血清核酸水平改變[10]。外周血標(biāo)本的采集操作簡(jiǎn)單，創(chuàng)傷極小，易得到患者接受，而血清/血漿游離核酸的測(cè)定則可避免腫瘤組織取標(biāo)本所帶來(lái)的創(chuàng)傷或并發(fā)癥。外周血游離核算包括游離DNA、RNA及miRNAs、lncRNAs等非編碼RNA等。報(bào)道[11]顯示，外周血miRNA水平存在腫瘤相關(guān)性及組織特異性。而相對(duì)于DNA、RNA這類(lèi)核酸來(lái)說(shuō)，miRNA更為穩(wěn)定，在多次反復(fù)凍融、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸、24 h的常溫環(huán)境等條件下仍可保持穩(wěn)定，有助于成為血液中的標(biāo)志物，并有望成為一種更加靈敏、特異、高效、微創(chuàng)的分子標(biāo)志物并進(jìn)一步應(yīng)用于腫瘤的早期診斷及患者預(yù)后的評(píng)估。

let-7為臨床上較早研究的一種miRNA，其序列、表達(dá)模式、調(diào)控功能均具有高度保守性。目前發(fā)現(xiàn)人類(lèi)成熟的let-7包含10個(gè)家族成員，由13個(gè)前體序列合成而來(lái)，包括：miR202、miR-98、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i；其中l(wèi)et-7a-1、let-7a-2、let-7a-3最終加工后生成let-7a。研究[12]顯示，let-7與腫瘤的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)，并在其中發(fā)揮了抑癌基因的作用。多項(xiàng)研究[13-15]表明在肺癌、結(jié)腸癌、霍奇金淋巴瘤等多種惡性腫瘤中均存在let-7表達(dá)量的顯著下降,說(shuō)明let-7表達(dá)的缺失可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。且有報(bào)道[16-17]顯示，恢復(fù)let-7的正常表達(dá)可阻止腫瘤的發(fā)生。因而let-7被公認(rèn)是一種抑癌基因，可經(jīng)與靶mRNA3′非翻譯區(qū)（3′UTR）相互結(jié)合,從而在影響靶mRNAs進(jìn)一步的翻譯，并影響靶基因的穩(wěn)定性甚至引發(fā)降解過(guò)程。報(bào)道[18-19]發(fā)現(xiàn)，let-7可經(jīng)與c-Myc、HMGA2、RAS等原癌基因的3′UTR相互結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)后，對(duì)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用。伴隨研究的逐步深入，let-7在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制報(bào)道越來(lái)越多，let-7將可能成為腫瘤診斷的新的分子標(biāo)記物與治療靶點(diǎn)。有報(bào)道[20]顯示，HCC組織中存在明顯的let-7a的下調(diào)，并與HMGA2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；let-7a可通過(guò)靶向抑制HMGA2的表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖與浸潤(rùn)。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者腫瘤細(xì)胞中存在lin28的高表達(dá)，可通過(guò)抑制let-7a的下調(diào)進(jìn)一步促進(jìn)let-7a有關(guān)靶基因c-myc的上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。盡管關(guān)于let-7與腫瘤的關(guān)系研究已廣泛開(kāi)展，但關(guān)于let-7a在肝癌血清中的改變情況及與腫瘤臨床病例特征的關(guān)系等尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用qRT-qPCR法測(cè)定HCC患者與入組健康者外周血let-7a水平發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清存在明顯的let-7a表達(dá)下調(diào)，較健康者血清水平差異有顯著差別，可能為HCC的重要血清分子生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)無(wú)癥狀的一類(lèi)早期HCC的診斷存在一定參考價(jià)值。進(jìn)一步對(duì)let-7a血清水平與HCC臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，血清let-7a水平與患者存在腫瘤的癌栓形成具有明顯關(guān)聯(lián)。癌栓是指腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、遷移過(guò)程中，患者血管、淋巴遭遇癌細(xì)胞侵犯，或?qū)е履惓?、血流?dòng)力障礙、血栓形成等病理改變，進(jìn)一步引起栓子發(fā)生，可出現(xiàn)于微循環(huán)、淋巴管及大小動(dòng)靜脈。本研究發(fā)現(xiàn)癌栓的發(fā)生于HCC患者外周血let-7a表達(dá)量明顯下降，推測(cè)可能和let-7a的表達(dá)下降后其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲能力的抑制作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致惡變細(xì)胞侵襲、擴(kuò)散能力增強(qiáng)，影響血液運(yùn)行后導(dǎo)致了血流動(dòng)力學(xué)障礙，甚至引起癌栓形成，表明血清let-7a水平對(duì)于HCC有一定的診斷價(jià)值。

報(bào)道[6,22]顯示，HCC組織中l(wèi)et-7a的表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)則表明HCC中人為制造上調(diào)的let-7a水平可抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。本研究中血清let-7a水平則與性別、年齡、HBV感染、肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤個(gè)數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、AFP水平無(wú)關(guān)，表明血清let-7a水平的改變情況對(duì)于腫瘤進(jìn)展過(guò)程的評(píng)估存在一定的局限性，當(dāng)然這可能與本研究樣本量過(guò)少有關(guān)，同時(shí)目前關(guān)于HCC患者血清let-7a研究尚無(wú)報(bào)道，其水平變化具體機(jī)制也尚不清楚，這些均有待進(jìn)一步大樣本研究進(jìn)行驗(yàn)證。AFP為目前臨床上公認(rèn)的HCC相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，應(yīng)用非常廣泛[23]。本研究中血清AFP對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者的診斷靈敏度為75%，特異度為96%，AUC為0.84，與相關(guān)報(bào)道[24]結(jié)果類(lèi)似；而聯(lián)合測(cè)定血清let-7a與AFP對(duì)HCC的診斷效率，靈敏度為83%，特異性為97%，AUC為0.92，均優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)AFP的診斷價(jià)值。提示聯(lián)合檢測(cè)血清let-7a與AFP比兩個(gè)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)對(duì)HCC具有更高的診斷效率，亦提升了AFP作為單一指標(biāo)檢測(cè)的診斷效能。

綜上，HCC患者血清let-7a水平出現(xiàn)下調(diào)，可能成為診斷HCC的新的分子標(biāo)志物。同時(shí)，PCR法技術(shù)成熟，操作簡(jiǎn)便，擴(kuò)增效率高，具有一定的臨床價(jià)值。

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