黨勝春，鄒松，劉路路，崔磊，陳吉祥，瞿建國，顧敏，張進

（1. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2. 江蘇省鎮(zhèn)江市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002）

原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，它對人類的健康造成極大的危害。并且，其患病率有不斷上升的趨勢[1]。隨著臨床檢驗血清AFP的應(yīng)用和影像技術(shù)的發(fā)展，越來越多的原發(fā)性肝癌能在其早期被發(fā)現(xiàn)[2]。與此同時，早期肝癌的治療也有所進步。但其5年生存率并沒有發(fā)生顯著改善[3]。所以，更深入的研究原發(fā)性肝癌，不可或缺。近年，研究者發(fā)現(xiàn)，除了基因變異和環(huán)境因素，表觀遺傳學(xué)改變也在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色[4]。

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系緊密[5]，它甚至可以作為腫瘤的一種潛在的生物標志[6]?；騾^(qū)域的甲基化在腫瘤抑制基因沉默表達中起著重要作用，是基因失活的主要機制之一。從而使腫瘤形成。比如有報道[7-8]稱，GPX3、GSTP1等基因在原發(fā)性肝癌中高度甲基化。

活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）最先在T淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)并因此而命名[9]。近年的研究[10]發(fā)現(xiàn)NFAT家族與腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移及血管形成有相關(guān)性。筆者[11]前期的研究已證實，NFAT2基因在肝癌組織較癌旁組織中表達有所降低。但其NFAT2沉默的原因尚未明確，本實驗旨在探究其沉默的原因。

1　材料與方法

1.1　研究對象

30例肝癌及癌旁標本均取自我院2010—2015年肝癌患者，癌旁組織為距離癌腫至少3 cm的肝組織。肝癌患者來院前未行放、化療；行肝癌切除術(shù)后將標本迅速置于液氮中保存。術(shù)后病理均證實為肝細胞性肝癌，其中男18例，女12例；低分化8例，中分化17例，高分化5例。人肝癌細胞系HuH7、HepG2、Hep3B和人正常肝細胞L02系均從中科院細胞庫購買。

1.2　方法

1.2.1基因組DNA的提取本研究提取組織及細胞系基因組DNA使用的是Axygen公司的AxyPrep基因組DNA小量試劑盒。操作步驟嚴格按照其說明書進行。向標本中加入350 μL PBS和0.8 μL RNase A，漩渦振蕩15 s，室溫靜置1 min，加入150 μL Buffer C-L和8 μL Proteinase K。立即漩渦振蕩1 min混合均勻。短暫離心后，將離心管置 56 ℃水浴10 min。加入350 μL Buffer P-D，漩渦振蕩30 s混合均勻，12000 r/min離心10 min。將DNA制備管置于2 mL離心管中，將混合液移至制備管中，12000 r/min離心1 min。棄濾液，將制備管置回到原來的2 mL離心管中，加入500 μL Buffer W1，12000 r/min離心1 min。棄濾液，將制備管置回原來的2 mL離心管中，加入700 μL Buffer W2，12000 r/min離心1 min，以同樣的方法，用700 μL Buffer W2再洗滌1次。產(chǎn)物溶于150 μL氨基丁三醇-乙二胺四乙酸緩沖液（Tris-EDTA，TE）。經(jīng)8 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，7550紫外分光光度儀定量。注意事項：為防止DNA降解，組織標本需在液氮中研磨至粉末后進行DNA提取。

1.2.2基因組總RNA的提取本研究提取組織及細胞系基因組RNA使用的是Axygen公司的AxyPrep基因組RNA小量試劑盒。操作步驟嚴格按照其說明書進行。向標本中加入400 μL Buffer R-I，用裝有21～25號針頭的注射器反復(fù)抽吸8～10次，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管（試劑盒內(nèi)提供）中。加入150 μL Buffer R-II，漩渦振蕩 15～30 s，12000 r/min 離心5 min。取上清至1.5 mL離心管中，加入250 μL異丙醇，混和均勻。將制備管置于2 mL離心管（試劑盒內(nèi)提供）中，轉(zhuǎn)移混合液到制備管中，6000 r/min離心1 min。棄濾液，將制備管置回到2 mL離心管中，制備管中加入500 μL Buffer W1A，12000 r/min離心1 min。棄濾液，將制備管置回到2 mL離心管中，制備管中加入700 μL Buffer W2，12000 r/min離心1 min； 以同樣的方法再用700 μL Buffer W2洗滌1次。棄濾液，將制備管置回到2 mL離心管中，12000×g離心1 min。將制備管放入一干凈的1.5 mL離心管（試劑盒內(nèi)提供）中，在制備管膜中央加 70～100 μL Buffer TE。室溫靜置 1 min，12000 r/min離心1 min，洗脫得RNA。經(jīng)紫外分光光度儀定量。注意事項：為防止RNA降解，組織標本須在液氮中研磨至粉末后進行RNA提取。并且實驗中的離心步驟需在4 ℃下進行。

1.2.3DNA亞硫酸氫鹽修飾DNA亞硫酸氫鹽修飾原理是基于亞硫酸氫鹽和氫醌能將DNA鏈上的C堿基轉(zhuǎn)變成U堿基；而當(dāng)C堿基被甲基化后，這一轉(zhuǎn)化將不會發(fā)生。這樣，甲基化與非甲基化的DNA序列經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾后，可通過序列特異的引物區(qū)分開來[12]。取1～2 μg基因組DNA，稀釋至 30 μL，加入 20 μL 0.5 mol/L NaOH，37 ℃下保溫15 min，變性DNA，然后加入新鮮配制的3 mol/L NaHSO3（pH 5.0）520 μL，10 mmol/L氫醌30 μL，混勻后50 ℃下孵育16 h。經(jīng)過亞硫酸氫鈉修飾的DNA以1%瓊脂糖透析回收純化，50 μL 0.6 mol/L NaOH，37 ℃ 10 min后終止反應(yīng)，乙醇沉淀回收DNA，將其溶解于30 μL無菌雙蒸水中，立即用于PCR擴增或于-80 ℃下保存。

1.2.4引物設(shè)計根據(jù)網(wǎng)站www.urogene.org/cgibin/methprimer/methprimer.cgi設(shè)計甲基化引物。MethPrimer（+）：GGG GGA GGT GTT TTT TAG TTT TAA A。MethPrimer（-）：CAA AAC CAA ATA AAA ACT TAA AAA AAA CTA。qRT-PCR引物由Beacon Designer 8軟件進行設(shè)計，引物設(shè)計在基因CDS區(qū)域內(nèi)。NFAT2（+）：TTC GGA ATC AGA GGA TAA。NFAT2（-）：AGG CTC ATA ATC ATC AGT。β-actin（+）：GGA CCT GAC TGA CTA CCT。β-actin（-）：CTT AAT GTC ACG CAC GAT T。

1.2.5PCR擴增選擇Takara公司的TaKaRa EpiTaq? HS （for bisulfite-treated DNA）試劑盒。退火溫度60 ℃。延伸時間60 s。

1.2.6qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄用Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒。熒光定量PCR用的是SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒。20 μL反應(yīng)體系包括1×SYBR Premix Ex Taq II，上下游引物0.4 μmol/L，1×ROX Reference Dye II，50 ng cDNA和7 μL H2O。 反應(yīng)在ABI7300擴增儀（ABI公司）上進行，擴增條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸1min，60 ℃收集熒光30 s，共40個循環(huán)。熔解曲線程序為 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。熔解曲線揭示PCR產(chǎn)物為單一峰，2%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物長度正確。

1.2.7轉(zhuǎn)化、克隆與測序此步驟使用北京艾德萊生物科技有限公司的Zero Background pTOPOBlunt Simple Cloning Kit，完全依照其產(chǎn)品說明書進行轉(zhuǎn)化，克隆。每份標本挑取10個單克隆，搖菌過夜，將菌液送往南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.8樣本的數(shù)據(jù)分析使用BLAST網(wǎng)站將測序數(shù)據(jù)與原數(shù)據(jù)進行對比。依據(jù)10個單克隆測序結(jié)果來計算每個位點的甲基化百分比。

1.3　統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計分析均在SPSS 20.0下完成。癌組織與癌旁組織CpG島甲基化差異采用配對樣本比較的Wilconxon符號秩檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖形制作在GraphPad 5.0和Photoshop CS5軟件下完成。

2　結(jié)　果

2.1　癌組織與癌旁組織NFAT2基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)比較

癌旁組織中的CpG島甲基化密度較低（6%位點檢測出了甲基化）。癌組織中的CpG島甲基化密度較高（82%位點檢測出了甲基化）。癌旁組織中甲基化的CpG島甲基化頻率較低（均≤25%）。癌組織中甲基化的CpG島甲基化頻率較高（其中34.15%的位點甲基化頻率＞50%）。并且從圖中可知，癌組織中的第4、6、7、38、40個CpG島位點更容易發(fā)生甲基化（頻率均＞75%）（圖1）。

分別計算所有患者的癌旁組織和癌組織的CpG島的甲基化頻率的算術(shù)平均數(shù)。癌旁組織CpG島甲基化頻率均數(shù)為（21.6±8.3）%，癌組織CpG島甲基化頻率均數(shù)為（33.0±13.9）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）（圖2）。

圖1　1例患者的癌旁及癌組織的啟動子中50個CpG位點甲基化頻率示意圖（藍色部分代表甲基化，紅色部分代表非甲基化）Figure 1　The frequency of methylation in 50 CpG islands in cancer tissue and adjacent normal tissue from one patient (blue bar representing methylated CpG dinucleotide, and red bar representing unmethylated CpG dinucleotide

圖2　癌組織與癌旁組織NFAT2啟動子甲基化程度的比較Figure 2　Comparison of the degrees of promoter methylation of NFAT2 between cancer tissue and adjacent normal tissue

2.2　人正常肝細胞與人肝癌細胞系NFAT2基因啟動子CpG島甲基化比較

人正常肝細胞L02的CpG島甲基化頻率均數(shù)為（16.2±6.9）%，HuH7細胞系CpG島甲基化頻率均數(shù)為（34.8±7.3）%，HepG2細胞系CpG島甲基化頻率均數(shù)為（40.4±10.3）%，Hep3B細胞系CpG島甲基化頻率均數(shù)為（37.0±10.1）%，各肝癌細胞系的CpG島甲基化頻率均明顯高于L02細胞（均P＜0.05）（圖3）。

2.3　癌組織NFAT2基因啟動子CpG島甲基化與相應(yīng)mRNA表達水平相關(guān)性研究

NFAT2 mRNA在癌組織與癌旁組織中的相對表達量分別為[（0.0006024±0.0002594） vs.（0.001469±0.0001711）]，癌組織中NFAT2 mRNA的表達水平明顯降低（P＜0.05）；Spearman相關(guān)分析顯示，肝癌組織中NFAT2 mRNA水平與其啟動子甲基化程度呈明顯負相關(guān)（r=-0.661，P=0.027）（圖4）。

圖3　人正常肝細胞系與肝癌細胞系NFAT2啟動中甲基化程度的比較Figure 3　Comparison of the degree of promoter methylation of NFAT2 in human normal hepatic cell line to those in HCC cell lines

圖4　癌組織NFAT2基因啟動子CpG島甲基化與NFAT2 mRNA表達水平的相關(guān)性分析Figure 4　Correlation analysis between the promoter methylation of NFAT2 and NFAT2 mRNA expression in HCC tissue

3　討　論

NFAT在基因的調(diào)控中起到了重要作用，從而影響著細胞周期的演進、生長、分化和凋亡[13]。目前有研究[17-19]表明，NFAT家族的中NFAT2與胰腺癌，乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌等腫瘤有著密切的關(guān)系，參與了腫瘤的增殖、侵襲、分化，腫瘤細胞的生存和腫瘤血管的形成。NFAT2是胰腺癌發(fā)展的基礎(chǔ)，并且在黑色素瘤細胞的存活以及結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移中起到了作用[14-16]。在部分淋巴瘤和白血病病例中，NFAT2也被檢測到了激活及過度表達。而在肝癌中對于NFAT的研究甚少，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)NFAT家族基因在肝癌組織較癌旁組織中表達降低，其中NFAT2差異最大，推測NFAT2基因可能在肝癌細胞形成和發(fā)展中作為抑癌基因發(fā)揮作用[11]。至于什么原因?qū)е翹FAT2基因在肝癌中表達減少目前不太清楚，因此本實驗主要探究NFAT2啟動子甲基化是否與其基因表達下降有關(guān)。

本研究通過重亞硫酸鹽測序法，對組織及細胞系NFAT2基因啟動子區(qū)進行測序。實驗結(jié)果表明，患者組織標本中癌組織較癌旁組織高甲基化，人肝癌細胞系較人正常肝細胞系高甲基化。結(jié)合甲基化會使基因表達沉默這一機制，本實驗提示NFAT2啟動子區(qū)域甲基化可能在肝癌NFAT2低表達中扮演重要角色，為了進一步驗證，本研究進行了NFAT2的表達與甲基化的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)肝癌中NFA2 mRNA水平與其啟動子甲基化水平呈負相關(guān)，推測NFAT2在肝癌中可能扮演著抑癌基因的角色，而抑癌基因的沉默促使著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。至于為何NFAT2在淋巴瘤和白血病中檢測到了激活及過度表達，而在肝癌中卻是低表達，筆者推測可能是由于NFAT2基因通過改變5′端起始外顯子區(qū)域的構(gòu)造，編碼NFAT2α和NFAT2β兩個亞型的原因[20]。有實驗[20-24]證實，T淋巴細胞、B淋巴細胞和肥大細胞通過NFAT2亞型特異性的調(diào)控和表達，調(diào)節(jié)著某些細胞因子。NFAT2α的高表達能抑制T細胞和B細胞的凋亡[20,22]。在伯基特淋巴瘤中，NFAT2α也被證實高表達，這就提示此亞型可能參與腫瘤的形成[25]。而NFAT2β通過上調(diào)一些凋亡基因[26]，促使細胞的凋亡，扮演著抑癌基因的角色[25]。在肝癌形成過程中，可能正是NFAT2啟動子高甲基化導(dǎo)致NFAT2β的低表達，進一步抑制下游凋亡基因表達從而導(dǎo)致肝癌細胞的發(fā)生和發(fā)展。本研究還提示所選啟動子區(qū)的第4、6、7、38、40個CpG島位點更容易發(fā)生甲基化（頻率均＞75%），是否這幾個位點的甲基化起到了關(guān)鍵作用，這還需后續(xù)的實驗進一步證實。至于NFAT2基因發(fā)生異常甲基化的機制，可能和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT）的功能異常有關(guān)。

探明NFAT2基因在肝癌中表達降低的機制，不僅能為以后腫瘤發(fā)生機制的研究提供新思路，而且還能為以NFAT2為核心的肝癌早期診斷和靶向治療提供新途徑。

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