王宇鋒，劉志奎，姚博文，李青，丁凌龍，涂康生，楊威

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，陜西 西安 710061）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1-4]。近年來隨著診療手段的不斷進步，HCC患者的預(yù)后已有一定的改善,但是HCC惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)的特點使得HCC患者的預(yù)后仍不能令人滿意[1-2,5-6]。因此，探究HCC細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在機制，尋找新的臨床有效的治療靶點是當前提升HCC診療水平的主要任務(wù)之一[1,6-9]。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來在腫瘤領(lǐng)域研究的熱點之一，它是一類長度約18～25個核苷酸序列的不編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA小分子[1,10]。miRNA作為癌基因或者抑癌基因，可以通過與下游靶基因的相互作用來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1,10-11]。miR-376c的長度為20～24個核苷酸序列，其可以通過參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯來影響基因的表達水平[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-376c在多種腫瘤中的表達趨勢不一，其在頭頸部鱗狀細胞癌[14]、膽管癌[15]及子宮頸癌[12]等腫瘤中表達下調(diào)，而在卵巢癌[16]中表達上調(diào)。并且在關(guān)于非小細胞肺癌的不同研究中，其在腫瘤組織中的表達趨勢也不一致[17-18]。異常表達的miR-376c可以通過調(diào)控其下游靶基因的表達水平來影響腫瘤細胞的侵襲、遷移、增殖、凋亡以及對化療藥物的敏感性等生物學(xué)行為[12,17-19]。但是miR-376c在肝細胞癌中的表達情況及其具體作用目前尚罕有報道。高遷移率族蛋白A2（high mobility group A2，HMGA2）是由HMGA2基因編碼的蛋白。研究[20-22]發(fā)現(xiàn)HMGA2在HCC中表達上調(diào)，可以受let-7、miR-107以及miR-663a等多種miRNA的調(diào)控從而促進HCC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，但是其是否受miR-376c調(diào)控目前也尚未報道。本研究首先探討了HCC組織中miR-376c的表達情況，然后分析miR-376c的臨床意義，并進一步應(yīng)用人工合成的miR-376c模擬物過表達HCC細胞中的miR-376c從而分析其對HCC細胞的作用。此外，還在HCC組織中分析了其與HMGA2表達的相關(guān)性?？傊狙芯恐饕骄苛薽iR-376c在HCC中的表達情況及其臨床意義，并初步探究miR-376c對HCC細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及潛在機制，旨在為研發(fā)真正臨床有效的HCC靶向治療藥物以及改善HCC的診治水平提供一定的研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　組織標本和細胞

收集并篩選83例HCC組織和對應(yīng)的癌旁組織標本，所有標本均來自2012年7月―2013年12月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科接受手術(shù)治療的HCC患者，其中男68例，女15例；年齡30～74歲，中位年齡49歲。所有患者的腫瘤標本均經(jīng)病理證實為HCC，對應(yīng)的癌旁組織為距腫瘤邊緣＞2 cm 的肝組織，術(shù)前均未接受化療、放療等其他輔助治療，所有組織取得后均盡快保存于液氮或者多聚甲醛（40 g/L）中?；颊咝g(shù)后隨訪時間為36個月。本課題經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準并且實驗獲得患者知情同意后開展的。正常永生化人肝細胞L02與肝癌細胞株MHCC-97L、SMMC-7721、MHCC-97H、Hep-3B、HepG2均購自中科院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。

1.2　實驗試劑

miR-376c特異性引物、miRNA 內(nèi)參U6引物、miR-376c過表達模擬物、陰性對照序列、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（All-in-One? miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit）以及miRNA qPCR試劑盒（All-in-One? miRNA qPCR Kit）均購自Genecopoeia公司。TRIzol試劑和脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）均購自Invitrogen公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco公司，DMEM購自ThermoFisher Scientific公司；ECL發(fā)光劑購自Milipore公司；兔抗人HMGA2多克隆抗體購自Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司；RIPA裂解液（強）購自西安赫特生物科技有限公司；Transwell小室購自Becton Dickinson Labware公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3　實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染正常肝細胞L02與MHCC-97H、HepG2、MHCC-97L、Hep-3B、SMMC-7721細胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于50 mL/L CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染操作按照LipofectamineTM2000試劑說明書上的步驟進行。首先用6孔板將細胞培養(yǎng)至融合度為50%～70%時，然后將100 nmol miR-376c模擬物及100 nmol陰性對照序列分別加入6孔板中，用無雙抗100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h后換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，后續(xù)轉(zhuǎn)染效果檢測及相關(guān)功能實驗在轉(zhuǎn)染48 h后收取細胞進行。

1.3.2real-time PCR按TRIzol試劑說明書上的步驟提取組織或者細胞中的總RNA,并應(yīng)用超微量核酸定量光譜儀（Thermo Nanodrop 1000）檢測RNA的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄操作按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書上的步驟進行。real-time PCR按照miRNA qPCR試劑盒說明書上的步驟進行，以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計算miR-376c的相對表達量。獨立重復(fù)實驗3次。miR-376c正向引物：5′-AAC ATA GAG GAA ATT CCA CGT-3′；U6 snRNA 正向引物：5′-CGC AAG GAT GAC ACG CAA ATT C-3′。

1.3.3Transwell小室遷移及侵襲實驗侵襲實驗時，先按1:8的稀釋比例將50 mg/L的Matrigel膠稀釋后鋪于小室底部；遷移實驗時不鋪膠 。收取轉(zhuǎn)染48 h 后的各組MHCC-97H 細胞，離心、重懸將細胞濃度調(diào)整為1×106個/mL。24孔板下室加入600 μL含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基，取各組細胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室。每組重復(fù)3個樣本。24 h后取出小室，首先用PBS溶液將小室清洗3次，然后用棉簽將小室的微孔膜上層的Matrigel 膠及細胞輕輕拭凈，接著用多聚甲醛（40 g/L，15 min）固定，用結(jié)晶紫（1 g/L，5 min）染色，并用PBS溶液洗凈，最后將小室置于倒置顯微鏡下進行觀察計數(shù)，每個樣本隨機選取5個視野進行計數(shù)并求其平均數(shù)，以此評估細胞的侵襲遷移能力。

1.3.4細胞劃痕實驗用記號筆在培養(yǎng)板背面畫3條橫行平行線，間距約0.5 cm，定位劃痕區(qū)域。將實驗組、對照組細胞用胰酶消化、用培養(yǎng)基重懸后均勻種于6孔板中，細胞密度約1×106個/mL，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當細胞均勻鋪滿板底，且為單層細胞時，將無菌直尺置于培養(yǎng)板上，與標記線垂直，用200 μL槍頭用力均勻沿直尺劃線，與標記線存在交叉點。PBS清洗3次，去除懸浮細胞，加入無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。于劃痕后0、48 h在倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.5免疫組化先將組織標本進行常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作4 μm切片。取出切片置于60 ℃烘箱中20 min，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶（37 ℃，10 min），抗原修復(fù)（0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液，96 ℃，15 min），滴加山羊血清液封閉（100 mL/L，37 ℃，10 min），滴加HMGA2抗體（1:200，4 ℃過夜），PBS洗滌后，滴加生物素標記的二抗（1:1000，37 ℃，60 min）；滴加鏈霉親和素-過氧化物酶（SP），37 ℃孵育40 min，DAB顯色8 min，在顯微鏡下掌握染色程度，自來水沖洗10 min終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染2 min，自來水沖洗15 min；常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。免疫組化評分= 染色強度評分×陽性細胞百分比評分，每張切片的最終評分為5個視野的平均分。染色強度評分：（-）為0分，（+）為1分，（++）為2分，（+++）為3分；陽性細胞（腫瘤細胞或肝細胞）百分比評分：0分為陽性細胞比例≤5%，1分為陽性細胞比例＞5%～≤25%，2分為陽性細胞比例＞25%～≤50%，3分為陽性細胞比例50%＞～≤75%，4分為陽性細胞比例＞75%。

1.3.6細胞蛋白抽提及Western blot實驗細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用RIPA裂解液抽提細胞總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。Western blot實驗時，首先將待檢測蛋白樣品按30 μg/孔上樣后行SDS-PAGE電泳，然后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫牛奶粉液封閉2.0 h后，加入相應(yīng)的HMGA2抗體（1:1000）或者β-actin抗體（1:1000），4 ℃孵育過夜。次日取出膜，在室溫孵育30 min，用TBST溶液（TBS，1 mL/L Tween-20）洗膜3次，10 min/次，洗去殘余的一抗；分別加HRP標記的抗兔或抗小鼠二抗（1:5000），室溫孵育2 h。TBST（TBS，1 mL/L Tween-20）洗膜3 次，8 min/次，洗去殘余的二抗后在暗室進行發(fā)光檢測目的蛋白。

1.3.7miRNA靶基因的預(yù)測應(yīng)用生物信息學(xué)軟件TargetScanHuman預(yù)測miR-376c的靶基因。

1.4　統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0等統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，使用的統(tǒng)計學(xué)方法包括t檢驗、Pearson χ2檢驗以及Pearman相關(guān)性檢驗等；用Graphpad Prism 6及Adobe PhotoShop CS5等作圖軟件進行圖表的繪制。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　HCC組織中miR-376c的表達

real-time PCR結(jié)果顯示，與在癌旁組織中的表達水平（3.4330±0.1202）比較，miR-376c在HCC組織中的表達水平（0.9667±0.1217）明顯下調(diào)（P＜0.01）（圖1）。

2.2　HCC組織中miR-376c表達量的臨床意義

以HCC組織中miR-376c的平均水平（0.9667±0.1217）為界，83例患者被分為miR-376c高表達組（44例）和miR-376c低表達組（39例）。分析miR-376c的表達與HCC患者的臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-376c的表達水平與門靜脈侵犯與否、TNM分期及Edmondson分級有關(guān)（均P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小、甲胎蛋白、腫瘤個數(shù)無關(guān)（均P＞0.05）（表1）。對兩組患者的隨訪進行分析，結(jié)果顯示，與miR-376c高表達組患者比較，miR-376c低表達組患者的3年總體生存率明顯要低（P＜0.01）（圖2）。

圖1　癌旁組織和HCC組織中miR-376c的表達Figure 1　The miR-376c expressions in HCC tissues and adjacent normal tissues

表1　HCC中miR-376c的表達量與臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]Table 1　Relations of miR-376c expression with clinicopathologic features of HCC [n (%)]

圖2　miR-376c高表達與低表達患者3年總體生存率比較Figure 2　Comparison of the 3-year overall survival rates between HCC patients with high and low miR-376c expression

2.3　miR-376c在不同的HCC細胞系中的表達

應(yīng)用real-time PCR檢測正常永生化人肝細胞L02以及不同的HCC細胞系MHCC-97H、HepG2、MHCC-97L、Hep-3B、SMMC-7721中miR-376c的表達水平。結(jié)果顯示，與在L02細胞中的表達相比，5種HCC細胞系中miR-376c的表達均明顯下調(diào)，而與其他4種HCC細胞系相比，MHCC-97H細胞中的miR-376c的表達量為最低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖3）。

圖3　miR-376c不同HCC細胞系與正常肝細胞中的表達Figure 3　The of miR-376c expressions in different HCC cell lines and normal hepatic cells

2.4　過表達miR-376c對HCC細胞的遷移與侵襲的影響

為探討miR-376c對HCC細胞生物學(xué)行為的影響，用miR-376c模擬物上調(diào)MHCC-97H細胞中的miR-376c的表達水平，用real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示，過表達組中miR-376c的表達水平（0.4000±0.5774）明顯高于陰性對照組（15.1700±0.4410），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。

圖4　轉(zhuǎn)染效果檢測Figure 4　Transfection eきciency determinations

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，過表達MHCC-97 H細胞的m i R-376 c后，遷移的細胞數(shù)目明顯減少[（56.00±2.00）vs.（26.00±1.16），P＜0.05]（圖5A-B）；Transwell侵襲實驗表明，相比對照組而言，過表達MHCC-97H細胞的miR-376c后，侵襲的細胞數(shù)目也明顯被抑制[（45.33±1.88）vs.（18.33±1.87），P＜0.01]（圖5C-D）。此外，劃痕實驗結(jié)果顯示，過表達MHCC-97H細胞的miR-376c后，劃痕的愈合率明顯降低[（95.33±1.45）% vs.（60.00±2.08）%，P＜0.01]（圖6）。

2.5　miR-376c可抑制HMGA2蛋白的表達

用生物信息學(xué)軟件（TargetScanHuman）分析發(fā)現(xiàn)，HMGA2可能為miR-376c的潛在的靶點之一（圖7A）。為了探討miR-376c是否能調(diào)控HMGA2的表達，分別在MHCC-97H細胞中轉(zhuǎn)染miR-376c模擬物和陰性對照序列，然后檢測對應(yīng)的細胞中HMGA2蛋白的表達變化，結(jié)果顯示，模擬物組細胞中的HMGA2蛋白表達水平明顯低于陰性對照組（P＜0.05）（圖7B）。

圖5　miR-376c對MHCC-97H細胞的遷移和侵襲能力的影響　A：Transwell實驗檢測細胞的遷移能力（×100）；B：遷移細胞數(shù)的統(tǒng)計圖；C：Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力（×100）；D：侵襲細胞數(shù)的統(tǒng)計圖Figure 5　Influence of miR-376c on migration and invasion abilities of MHCC-97H cells　A: Cell migration ability measured by Transwell assay (×100); B: Statistical plot of number of migrating cells; C: Cell invasion ability measured by Transwell assay (×100);D: Statistical plot of numbers of invading cells

圖6　劃痕實驗檢測細胞的遷移能力Figure 6　Cell migration ability measured by wound scratch healing assay

圖7　miR-376c對HMGA2表達的影響　A：生物信息學(xué)分析顯示miR-376c可與HMGA2基因的3′非編碼區(qū)結(jié)合；B：過表達miR-376c的MHCC-97H細胞中HMGA2蛋白水平降低Figure 7　Influence of miR-376c on HMGA2 expression　A: Bioinformatics analysis showing that miR-376c binds to 3’-UTR site of HMGA2 gene; B: Overexpressed miR-376c decreasing HMGA2 protein expression in MHCC-97H cells

2.6　HCC組織中miR-376c表達水平與HMGA2蛋白表達水平的相關(guān)性

為了進一步證實miR-376c可調(diào)控HMGA2蛋白的表達，應(yīng)用免疫組化法分別檢測了miR-376c高表達組和低表達組的HCC組織中HMGA2的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGA2在HCC組織中的染色為棕黃色或者棕褐色，主要著色部位為細胞核，有部分存在于細胞質(zhì)或者細胞膜上（圖8A-B）。并且，miR-376c高表達組中的HMGA2蛋白表達強度明顯低于miR-376c低表達組[（1.00±0.12）vs.（6.50±0.13）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖8C）。

此外，為了進一步明確miR-376c和HMGA2的表達量之間的相關(guān)性，采用了Spearman相關(guān)分析法進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，在HCC組織中，miR-376c 與HMGA2的表達呈明顯負相關(guān)（r=-0.541，P＜0.01）（圖8D）。

圖8　HCC組織中miR-376c和HMGA2的表達量的相關(guān)性　A-B：miR-376C低表達和高表達HCC組織中HMGA2的表達檢測（×400）；C：HMGA2的免疫組化評分；D: Spearman法分析miR-376c與HMGA2表達量的相關(guān)性Figure 8　Correlation of miR-376c expression with HMGA2 expression in HCC tissues　A–B: The HMGA2 expression in HCC tissues with low and high miR-376C expression (×400)；C: Immunohistochemistry score for HMGA2; D: Spearman correlation analysis of correlation between miR-376c and HMGA2 expression

3　討　論

HCC是最致命的腫瘤之一，盡管過去數(shù)十年HCC的治療手段已經(jīng)有了諸多改善，但是目前HCC患者的生存率仍然不容樂觀[5,23]。因此，尋找新的治療靶點，有效推動HCC靶向治療的發(fā)展是目前需要迫切解決的問題[4,23]。miRNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA小分子,可在腫瘤中異常表達，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1,24-26]。系列研究發(fā)現(xiàn)，miR-376c在骨肉瘤、膽管癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌等腫瘤中均為異常表達，其作為抑癌基因或者癌基因可以參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移以及化療抵抗性等生物學(xué)行為[12,14-16,19,27]。Jin等[28]研究發(fā)現(xiàn)，miR-376c在骨肉瘤組織和細胞系中均為低表達，并且miR-376c可通過直接靶向作用于TGF-α來抑制骨肉瘤的生長和侵襲；Iwaki等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-376c在膽管癌中為抑癌基因，能夠抑制膽管癌細胞的侵襲和遷移；Ye等[16]研究發(fā)現(xiàn)，過表達卵巢癌細胞中的miR-376c可以促進腫瘤細胞的增殖，增加腫瘤細胞對化療藥物的抵抗性。而miR-376c在HCC中的表達情況及其對HCC細胞的作用及其機制目前尚罕有報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中miR-376c的表達水平明顯下調(diào)，且與HCC的門靜脈侵犯與否、TNM分期及Edmondson分級顯著相關(guān)，此外，miR-376c高表達組HCC患者預(yù)后較好。上述結(jié)果提示，在HCC中，miR-376c為抑癌基因，且可能對腫瘤細胞的侵襲、遷移具有抑制作用。為了探究miR-376c對HCC細胞的侵襲、遷移的影響，本研究首先檢測了miR-376c在HCC細胞系中的表達情況。與在HCC組織標本中的表達情況一致，miR-376c在HCC細胞系中的表達與正常肝細胞相比明顯下調(diào)。而Transwell遷移侵襲實驗以及細胞劃痕實驗結(jié)果均表明，miR-376c可以抑制HCC細胞的遷移及侵襲能力，這和在膽管癌[15]、骨肉瘤[28]中的研究結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，miR-376c為HCC的抑癌基因，可以通過抑制HCC細胞的侵襲遷移能力從而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。

為進一步探討miR-376c在HCC中的潛在作用機制，本研究首先應(yīng)用生物信息學(xué)工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-376c在HCC中的可能的作用靶點之一為HMGA2。而據(jù)文獻[21]報道，HMGA2在HCC中為過表達，可促進HCC細胞的侵襲、遷移、EMT及增殖，并且HMGA2可通過與miRNA相互作用，從而共同調(diào)節(jié)HCC的發(fā)生發(fā)展。例如，Huang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-603a可以抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲，它可以通過直接作用于HMGA2來發(fā)揮其抑癌作用。因此，結(jié)合生物信息學(xué)資料和相關(guān)文獻報道推測，在HCC中HMGA2可以受miR-376c的調(diào)控。實驗結(jié)果顯示，上調(diào)HCC細胞中的miR-376c的表達水平后HMGA2的蛋白水平相應(yīng)下調(diào)。這提示miR-376c可能通過負向調(diào)控HMGA2的表達水平發(fā)揮作用。為了進一步證實上述結(jié)果，本研究分析了HCC組織中miR-376c的表達和miR-376c表達水平的相關(guān)性。首先應(yīng)用免疫組化染色檢測HMGA2蛋白在miR-376c高表達組和低表達組的HCC組織中的表達情況并進行Spearman相關(guān)分析。結(jié)果顯示，HMGA2蛋白在miR-376c低表達組的HCC組織中HMGA2蛋白的表達明顯要強；Spearman相關(guān)分析顯示，HCC組織中的miR-376c和HMGA2的表達呈明顯負相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果進一步說明了，HMGA2可能是miR-376c的下游直接作用靶點。但是在HCC中，miR-376c是否可通過負向調(diào)控HMGA2蛋白的表達發(fā)揮其抗HCC遷移與侵襲的作用，miR-376c的上游調(diào)控因子及機制如何，以及HMGA2是否是miR-376c的直接作用靶點和具體作用機制都有待進一步深入研究。

綜上，HCC中miR-376c的表達下調(diào)，并且與患者的門靜脈侵犯、TNM分期及Edmondson分級及預(yù)后密切相關(guān)。此外，miR-376c能抑制HCC細胞的侵襲與遷移，而HMGA2可能是miR-376c的下游直接作用靶點。因此，本研究可能為HCC靶向治療的研究提供一定的實驗基礎(chǔ)。

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