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石榴種質資源ITS序列分析

徐會麗1，2，張?zhí)?，2，苑兆和1，2*

(1.南京林業(yè)大學/南方現代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210037；2.南京林業(yè)大學林學院 )

以13個石榴品種的嫩葉為試材提取DNA，進行ITS-PCR擴增。對擴增產物的測序結果構建進化樹進行親緣關系分析。結果表明，13個品種的ITS區(qū)段長度在619～704bp之間，轉換和顛換比值0.75。系統(tǒng)發(fā)育樹表明13個石榴品種資源聚為三類，與傳統(tǒng)分類學相互支持。ITS序列分析與傳統(tǒng)形態(tài)分類學相結合的手段為今后石榴的研究、鑒定、分類提供新的思路。

石榴，ITS序列，系統(tǒng)進化樹

石榴(PunicagranatumL.)是千屈菜科(Lythraceae)石榴屬(PunicaL.)落葉果樹[1]，中國栽培歷史悠久[2]。石榴以形態(tài)美觀、營養(yǎng)價值豐富而深受人們的喜愛[3]。目前對石榴品種的鑒定主要還是依據形態(tài)學特征和生態(tài)分布，但并未形成統(tǒng)一標準。ITS(內部轉錄間隔區(qū))序列(核糖體RNA基因非轉錄區(qū)的一部分)是介于18S和28S(S為核糖體RNA的沉降系數)之間的非編碼轉錄間隔區(qū)[4]，已被證實是研究許多被子植物類群系統(tǒng)與進化的重要的分子標記，能較好地反映植物科內、屬間、種間的親緣關系，近年來被廣泛應用于植物的系統(tǒng)演化和親緣關系的研究。筆者從分子進化和系統(tǒng)發(fā)育角度探討ITS序列與石榴不同栽培品種的親緣關系，提取13個石榴品種的DNA，采用ITS-PCR擴增產物測序獲得其序列，應用Dnasp5.0[5]軟件分析ITS序列特征，Clustalx2和MEGA5.0軟件構建進化樹，從DNA水平探討石榴栽培品種之間的親緣關系，為石榴種質的研究、鑒定、分類提供新思路。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

13個石榴品種(表1)：奧斯丁(Austin)、超大籽、

白皮大籽、魯峪蛋、墨石榴、一串鈴、銅皮、凈皮甜、俄羅斯(Russia)、厚皮白籽、魯白榴2號、大粒、秋艷，2013～2015年陸續(xù)從山東、陜西、云南等地引進栽植于南京林業(yè)大學白馬教學基地。2015年3月28日取新鮮石榴葉片液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 DNA提取

提取13個石榴品種每個品種的DNA：將采集的葉片放入液氮中快速研磨至粉狀，用上海生工生產的磁珠法基因組DNA提取試劑盒(植物)提取樣品總DNA。

1.3 ITS序列的PCR擴增及測序

PCR(聚合酶鏈反應)擴增采用通用引物ITS1和ITS4，上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，由上海生工公司合成。2×Taq PCR MasterMix由北京天根生化科技有限公司提供。PCR反應體系為25μL，DNA模板1μL，Taq酶12.5μL，引物ITS1和ITS4各1μL，水9.5μL。PCR反應程序為：94℃預變性3分鐘；94℃變性3分鐘，55℃退火30秒鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)；72℃延伸10分鐘；4℃保存10分鐘。取PCR產物5μL用核酸染色劑4S gree(由上海生工提供)染色，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢

測，用凝膠成像儀拍照。用分光光度計測量DNA濃度。剩余的PCR產物委托上海生工科技有限公司正反測序。

1.4 ITS序列分析

將測序得到的13個石榴品種的ITS序列用ContigExpress軟件進行拼接后，用ClustalX2完成DNA序列比對，保存aln格式，運用MEGA5.0軟件采用鄰接距離矩陣法(Neighbor-joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，應用自展法(Bootstrap，1000 replicates) 進行可信度檢測，重復1000 次。完全刪除序列的Gaps/Missing Data，采用Pairwise deletion法，選用Kimura 2-parameter 模型進行遺傳距離計算。運用Dnasp5.0軟件進行堿基組成、變異位點數、簡約信息位點、轉換和顛換數等分析。

2 結果與分析

2.1 提取DNA結果

13份石榴種質葉片DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現所得DNA條帶單一無拖帶現象，說明提取的DNA質量較高；在DNA多次重復提取過程中，選擇提取過程中DNA濃度和純度都比較高，其中濃度要求在100μg/μL左右。

表1 13個石榴品種的ITS序列長度和堿基G+C含量

2.2 ITS-PCR擴增結果

以提取的DNA為模板，以通用引物ITS1和ITS4進行擴增，結果顯示退火溫度55℃時擴增效果較好，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示DNA片段長度約700bp。

2.3 ITS序列分析

利用DNAMAN[6]軟件對所測13個品種的ITS序列進行組分分析，結果如表1，石榴科供試的13個品種中，只有墨石榴G+C含量達到66.6%，其余12個品種的G+C含量均在65.2%～65.7%之間。13個供試品種的平均G+C含量為65.47%。因此整體含量差異不明顯，適于做遺傳分析。

2.4 ITS序列變異分析

ITS序列變異分析主要包括轉換、顛換、缺失和插入[6]。Dnasp5.0分析表明：13個石榴品種的ITS序列位點中多態(tài)性位點(Polymorphics sites)為23，簡約信息位點數(Parsimonyinformative sites)為16。核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)Pi值為0.00025，Theta值為0.00052。ITS1區(qū)存在A、G缺失，ITS4區(qū)存在T、A、G插入和 A、C、T缺失，轉換和顛換比值約為0.75(由表2中轉換總數和顛換總數比值可得)。

表2 13個石榴品種的ITS序列變異

2.5 石榴科植物的ITS聚類分析

將13個石榴試驗樣品與NCBI中同源搜索的4個同源性高的千屈菜科麗薇屬的4個品種(其genbank登錄號分別為KF494261.1、KF420995.1、JN701292.1、AY905425.1)作為外群，先用ClustalX2.0軟件進行序列的完全比對，再用MEGA5.0軟件NJ法構建系統(tǒng)進化樹[7](圖1)，完全刪除序列的Gaps/Missing Data，采用Pairwise deletion法，選用Kimura2-parameter 參數模型，所得的遺傳距離見表3。

13個石榴品種被分為2支，其中魯峪蛋、墨石榴、一串鈴以100%的支持率被分為一類，其他10個品種被分為一類。其中墨石榴和一串鈴僅以50%的支持率聚為一支，說明兩者差異度較大。這從形態(tài)指標上來說墨石榴是月季石榴的變種，屬極矮生種，節(jié)密，根部可形成堆塔，果皮及籽粒紫黑色，而一串鈴串狀結果，果皮粉紅，核軟可食，兩者形態(tài)差異較大相一致。

由圖1看，奧斯丁(Austin)、超大籽、白皮大籽、銅皮、凈皮甜、俄羅斯(Russia)、厚皮白籽、魯白榴2號、大粒、秋艷10個品種以62%的支持率分為2支，其中厚皮白籽、秋艷、Russia、銅皮、凈皮甜聚為一類。其中Russia單獨成一支，這是由于Russia品種引種于美國，可能原因是長期環(huán)境變化引起的差異。而魯白榴2號、大粒、白皮大籽、Austin、超大籽5個品種聚為一類。其中白皮大籽、Austin、超大籽都單獨形成一支，說明三者親緣關系較遠，由《中國果樹志石榴卷》可知白皮大籽以果皮白色較為少見，Austin引種于美國與其他中國品種差異較大，超大籽以籽粒大、果大而著稱。因此奧斯丁(Austin)、俄羅斯(Russia)、白皮大籽同其他品種形態(tài)指標上的差異也支持了三者親緣關系較遠的論點。

圖1 鄰接距離矩陣法構建的石榴科植物ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

由表3可知，1號Austin與5號墨石榴、6號一串鈴、12號大粒三者之間的Kimura 2-parameter距離范圍為0.001～0.035，平均遺傳距離為0.013。說明Austin與墨石榴、一串鈴、大粒三個品種之間親緣關系較遠。而Austin、2號超大籽、3號白皮大籽相互間Kimura 2-parameter距離均為0. 000，說明這3個品種親緣關系較近。

表3 石榴科植物ITS 序列間的遺傳距離

注：橫向編號為列數，縱向編號所代表的品種為[1]-Austin，[2]-超大籽，[3]-白皮大籽，[4]-魯峪蛋，[5]-墨石榴，[6]-一串鈴，[7]-銅皮，[8]-凈皮甜，[9]-Russia，[10]-厚皮白籽，[11]-魯白榴2號，[12]-大粒，[13]-秋艷。

3 討論

由于ITS區(qū)具有較豐富的信息位點和變異位點，目前已有文獻證實ITS是研究許多被子植物類群系統(tǒng)與進化的重要分子標記。由于ITS能較好地反映出科內、屬間、種間的親緣關系，所以被廣泛應用于植物的系統(tǒng)演化及親緣關系的研究[8-15]。本研究通過Dnasp5.0分析ITS序列特征，表明供試石榴種質材料ITS核苷酸多樣性的Pi值和Theta值均很低，說明石榴屬ITS不存在假基因現象，符合被子植物ITS 協(xié)同進化規(guī)律[16,17]。其中凈皮甜、銅皮、Russia堿基相似度非常高，可見三者之間的親緣關系非常近。長期以來，園藝學家對石榴種下分類等級持有不同見解，其親緣關系和系統(tǒng)進化過程很難確定。本研究對石榴科13個栽培品種進行ITS序列分析，其中墨石榴、一串鈴和Austin不僅在形態(tài)上差異顯著，在親緣關系上也和其他10個品種差異明顯，研究結果支持了形態(tài)差異是一定程度進化的結果。形態(tài)差異為間接判斷親緣關系提供直觀根據。

目前有關石榴科植物的親緣關系的報道較少。石榴科僅1個屬2個種，一種產于印度洋的索克拉克島上(PunicaprotopunicaBalf)，為野生種，無栽培價值。作為栽培的只有一個種即石榴(PunicagranatumL)。因此，對石榴的分類都在同一個種下進行，從分子方面來講難免差異度很小。本文利用ITS序列分析嘗試從進化方面分析石榴種質間的親緣關系，為石榴科植物分類提供一種新的方法和思路。未來研究結果還需要選取更多品種來進行驗證，以進一步為石榴科植物分類提供理論依據。

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2016-10-24

國家自然科學基金項目(31272143)；南京林業(yè)大學高層次人才科研啟動基金(GXL2014070)；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程項目(PAPD)。

徐會麗(1993-)，女，江蘇鹽城人，研究生，主要研究構建石榴組織培養(yǎng)體系。E-mail: xuhuili_xul5986@126.com

S665.4

A

1002-2910(2017)02-0004-04

*通訊作者：苑兆和(1963-)，男，山東招遠人，教授，博士生導師，研究方向為經濟林培育與分子生物學。