孫玉軍，江昌俊，任四海

（1.安徽科技學院生命科學學院，安徽 鳳陽 233100；2.安徽農業(yè)大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；3.安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院，茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036；4.安徽省農業(yè)科學院煙草研究所，安徽 合肥 230031）

秀珍菇多糖對D-半乳糖致衰老小鼠的保護作用

孫玉軍1,2，江昌俊3,*，任四海4

（1.安徽科技學院生命科學學院，安徽 鳳陽 233100；2.安徽農業(yè)大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；3.安徽農業(yè)大學茶與食品科技學院，茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036；4.安徽省農業(yè)科學院煙草研究所，安徽 合肥 230031）

研究秀珍菇子實體多糖（polysaccharide from the fruiting body of Pleurotus geesteranus，PFP）對D-半乳糖致衰老小鼠的保護作用。通過腹腔注射60 mg/（kg·d）D-半乳糖建立衰老小鼠模型，同時灌胃50、100、200 mg/（kg·d）不同劑量的PFP，42 d后，采用試劑盒測定小鼠肝、腦組織中過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量；同時，對小鼠血清谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatas，ALP）活力以及脾臟指數、胸腺指數進行測定；蘇木精-伊紅染色觀察肝、腦組織。結果表明，PFP能拮抗D-半乳糖引起的小鼠衰老，使小鼠肝、腦組織中的CAT、SOD、GSH-Px活力升高，MDA含量降低。與模型組相比，中、高劑量組PFP顯著降低小鼠血清的AST、ALP、ALT活力（P＜0.05，P＜0.01），極顯著提高脾臟指數和胸腺指數（P＜0.01）；組織切片顯示PFP對小鼠肝、腦損傷具有保護作用。因此PFP具有良好的抗衰老作用，其機制可能與其提高機體的抗氧化能力、增強機體的免疫功能有關。

秀珍菇；多糖；D-半乳糖；抗氧化；抗衰老

食用菌是一類可供食用的大型真菌，味道鮮美，營養(yǎng)價值高，深受消費者的喜愛。食用菌多糖是其一種重要的活性成分。目前研究表明，食用菌多糖具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]、抗衰老[3]、抗突變[4]、提高機體免疫力[5]等多種生物功能。

秀珍菇（Pleurotus geesteranus）是人們經常食用的一種菌類，屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、側耳科、側耳屬[6]。目前秀珍菇的研究主要集中在栽培工藝[7-9]，液體發(fā)酵[10-11]等方面，對于其活性物質多糖的提取[12]、抑瘤活性[13]、抗氧化活性[14]等方面也有文獻報道，但對于抗衰老方面的研究尚鮮見文獻報道。

目前，多糖有酶法提取[15]、超聲提取[16]、微波提取[17]、超高壓提取[18]、超臨界提取[19]等多種方法，不同的方法各有其優(yōu)缺點。閃式提取是近年來發(fā)展起來的一種高效的提取方法，其原理是利用高速機械剪切力和超速動態(tài)分子的滲濾作用，在室溫條件下將植物、食用菌子實體等材料破碎成細微顆粒，具有提取效率高、能耗低等優(yōu)點，適合多糖等活性物質的有效提取[20]。本實驗采用閃式提取、乙醇沉淀制備秀珍菇子實體多糖（polysaccharide from the fruiting body of Pleurotus geesteranus，PFP），采用小鼠腹腔注射D-半乳糖建立衰老模型，同時灌胃不同劑量的PFP，通過測定小鼠肝、腦組織中過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量以及小鼠血清谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatas，ALP）、谷丙轉氨酶 （alanine aminotransferase，ALT）活力指標，計算脾臟指數、胸腺指數，并對其肝、腦組織切片進行觀察，來探討秀珍菇多糖的抗氧化和抗衰老功能，為秀珍菇多糖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、實驗動物與試劑

秀珍菇子實體：由安徽科技學院食用菌研究所栽培獲得。

昆明種小鼠，雄性，體質量（20±2） g，SPF級，批準號：SCXK（滬）2012-0006，購于上海杰思婕實驗動物有限公司。

CAT測試盒、SOD測試盒、GSH-Px測試盒、MDA測試盒、總蛋白測試盒 南京建成生物工程研究所；D-半乳糖、VC 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JHBE-50T閃式提取器 河南智晶生物科技股份有限公司；V-5000型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；X-22R型冷凍離心機 美國Beckman公司；H-18R型離心機 北京安必升科技發(fā)展有限公司；1510型酶標儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BS-200型全自動生化分析儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；2235型輪轉切片機 德國萊卡測量系統(tǒng)設備有限公司； BA410型顯微攝影系統(tǒng) 廈門麥克奧迪實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 秀珍菇多糖的制備

秀珍菇子實體經冷凍干燥，粉碎機粉碎，過100 目篩。取300 g粉末，加入8 000 mL 蒸餾水，電子轉速8 000 r/min，閃式提取器提取2 min，5 000 r/min離心10 min，上清液旋轉蒸發(fā)濃縮至適當體積，加入3 倍體積95%乙醇于4 ℃冰箱中沉淀過夜，5 000 r/min離心10 min，沉淀復溶，冷凍干燥得PFP。

經測定PFP的總糖及蛋白含量分別為60.42%、18.91%，與Molish反應呈陽性；易溶于水，不溶于高體積分數的乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑；與I-KI反應不顯示藍色，因此PFP是一種非淀粉類多糖復合物。

1.3.2 小鼠分組及處理

將60 只小鼠適應性飼養(yǎng)一周，隨機分成6 組，每組10 只，分別為：正常對照組、模型對照組、陽性對照組（VC）、PFP低劑量組（PFP-L）、PFP中劑量組（PFP-M）、PFP高劑量組（PFP-H）。除正常對照組外，其他各組腹腔注射D-半乳糖，劑量為60 mg/（kg·d），以體質量計，下同；正常對照組的小鼠注射相同劑量（60 mg/（kg·d））生理鹽水；低、中、高劑量組分別以50、100、200 mg/（kg·d）的PFP灌胃，陽性對照組每天灌胃50 mg/（kg·d）的VC，正常對照組及模型對照組則灌胃等體積的生理鹽水，持續(xù)處理42 d。

1.3.3 小鼠實驗樣本的采集

第42天給藥12 h后，稱質量，采用斷頸法處死小鼠，采集血樣并解剖，分別提取肝臟、腦，脾、胸腺，濾紙吸干、稱質量。肝臟、腦組織分成2 份，一份于10%福爾馬林中固定，用于組織切片觀察；另一份按照器官1∶9（m/V）的比例加入冷生理鹽水，剪碎，用玻璃勻漿器冰浴研磨制備10%的組織勻漿，3 800 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，用于組織生化指標測定。血液于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清，用于血清生化指標測定。

1.3.4 生化指標測定

肝、腦組織勻漿的CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量測定均按照試劑盒說明書的方法進行；脾臟指數、胸腺指數均按組織的質量（mg）與小鼠的體質量（g）的比值來表示；血清中的AST、ALT、ALP活力利用全自動生化分析儀測定。

1.3.5 組織切片觀察

從固定液中取出肝、腦組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，顯微觀察。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響

表 1 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 1 Effect of PFP on the activities of CAT, SOD and GSH-Px, and the contents of MDA in liver of mice

不同處理對小鼠肝臟CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響見表1。由表1可知，正常對照組小鼠肝臟的CAT、SOD活力極顯著高于模型組（P＜0.01），GSH-Px活力顯著高于模型對照組（P＜0.05），而MDA含量極顯著低于模型對照組（P＜0.01），說明造模成功。多糖低劑量組小鼠肝臟CAT、GSH-Px活力較模型對照組略有升高，但不顯著，而SOD活力較模型對照組顯著升高、MDA含量較模型對照組顯著降低（P＜0.05）；多糖中劑量組小鼠肝臟CAT、SOD、GSH-Px活力較模型對照組均顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著下降（P＜0.05）；高劑量組、VC組小鼠肝臟CAT、SOD活力均極顯著高于模型對照組（P＜0.01），GSH-Px活力顯著高于模型對照組（P＜0.05），而MDA含量均極顯著低于模型對照組（P＜0.01）。

2.2 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠腦CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響

表 2 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠大腦CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 2 Effect of PFP on the activities of CAT, SOD and GSH-Px and the contents of MDA in brain tissues of mice

不同處理對小鼠腦CAT、SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響見表2。由表2可知，正常對照組小鼠腦的CAT、SOD、GSH-Px活力極顯著高于模型對照組（P＜0.01），而MDA含量極顯著低于對照模型組（P＜0.01），說明造模成功。多糖低劑量組小鼠腦GSH-Px活力較模型對照組略有升高，但不顯著，而CAT、SOD活力較模型對照組顯著升高（P＜0.05），MDA含量較模型對照組略有下降；多糖中劑量組小鼠腦CAT、SOD、GSH-Px活力較模型對照組均顯著升高（P＜0.05），而MDA含量較對照模型組顯著下降（P＜0.05）；多糖高劑量組、VC組小鼠肝臟CAT、SOD、GSH-Px活力均極顯著高于模型對照組（P＜0.01），而MDA含量均極顯著低于模型對照組（P＜0.01）。

2.3 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠胸腺指數、脾臟指數的影響

不同處理對小鼠胸腺指數、脾臟指數的影響見表3，正常對照組小鼠胸腺指數、脾臟指數顯著高于模型對照組（P＜0.05），說明造模成功。多糖低劑量組小鼠胸腺指數、脾臟指數較模型對照組顯著升高（P＜0.05）；多糖中劑量組、高劑量組、VC組小鼠胸腺指數、脾臟指數極顯著高于模型對照組（P＜0.01）。

表 3 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠胸腺指數、脾臟指數的影響Table 3 Effect of PFP on thymus index and spleen index of mice mg/g

2.4 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠血清AST、ALP、ALT活力的影響

表 4 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠血清AST、ALP、ALT活力的影響Table 4 Effect of PFP on the activities of AST, ALP and ALT in serum of mice U/L

不同多糖處理對小鼠血清AST、ALP、ALT活力的影響見表4。正常對照組小鼠血清AST、ALP、ALT活力均極顯著低于模型對照組（P＜0.01），說明造模成功。多糖低劑量組小鼠血清AST、ALP、ALT活力較模型對照組略有下降，但不顯著；多糖中劑量組小鼠血清AST、ALP、ALT活力顯著低于模型對照組（P＜0.05），多糖高劑量組、VC組小鼠血清AST活力顯著低于模型對照組（P＜0.05），多糖高劑量組、VC組小鼠血清ALP、ALT活力極顯著低于模型對照組（P＜0.01）。

2.5 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠肝組織的影響

PFP對D-半乳糖致衰老小鼠肝組織的影響如圖1所示。正常對照組肝臟組織結構正常，肝細胞相互連接形成肝板，以中央動脈為中心向周圍呈輻射狀形成肝小葉，肝細胞之間空隙形成肝血竇。衰老模型組肝細胞內炎性細胞較多，偶見炎性細胞聚集，細胞胞核較大，胞漿疏松；VC陽性對照組肝臟組織結構正常，顯微鏡下肝臟組織結構完整，著色較好，細胞結構較模型對照組清晰。PFP低、中、高劑量組肝臟組織結構正常，著色清晰，肝血竇明顯，結構完整，細胞界限明顯，胞核胞漿未發(fā)現異常，形態(tài)結構較好。

圖 1 小鼠肝臟組織切片（×200）Fig. 1 Observation of liver histological sections (× 200)

2.6 PFP對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織的影響

圖 2 小鼠腦組織切片（×200）Fig. 2 Observation of brain histological sections (× 200)

PFP對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織的影響如圖2所示。正常對照組大腦組織結構正常，大腦皮層分子層、顆粒細胞層、錐體細胞層分層較明顯；與正常對照組相比較，衰老模型組分子層較對照組厚，細胞分層不明顯，錐體細胞數量較少，散落分布；VC陽性對照組分子層較對照組薄，細胞分層明顯，錐體細胞數量較少；PFP低、中、高劑量組大腦分子層明顯較薄，細胞分層明顯，錐體細胞明顯增多，且分子層較VC陽性對照組薄，錐體細胞層內錐體細胞數量明顯較多。

3 討論與結論

長期注射一定劑量的D-半乳糖，在小鼠體內代謝得到大量的半乳糖醇，不能被進一步代謝因而堆積起來，影響細胞正常的滲透壓，導致細胞腫脹，代謝紊亂[21]。同時，D-半乳糖在小鼠體內代謝氧化產生大量的自由基，超過機體正常的清除能力，即氧化與抗氧化的動態(tài)平衡被打破，使細胞極易受到自由基的攻擊從而引起衰老的發(fā)生。D-半乳糖致衰老的過程與機體的自然衰老過程較為相似，因此D-半乳糖誘導氧化應激導致小鼠衰老，已被廣泛應用于抗氧劑、抗衰老藥物等的篩選[22-23]。

MDA是機體內的自由基引發(fā)脂質過氧化的一種產物，常被作為評價衰老的一種指標[24]。SOD是體內一種重要的抗氧化酶，能夠有效清除超氧陰離子自由基，降低MDA及自由基代謝產物的產生，使細胞免受破壞。本實驗中，秀珍菇多糖的低、中、高各劑量組與模型對照組相比，肝臟組織和腦組織中的SOD活力均顯著提高（P＜0.01，P＜0.05），且呈現一定的量效關系，表明秀珍菇多糖清除自由基的能力較強，阻斷自由基的鏈式反應，能夠拮抗D-半乳糖致小鼠的衰老。與模型對照組相比，秀珍菇多糖的低劑量組MDA含量稍有下降，中、高劑量組MDA含量下降顯著（P＜0.01，P＜0.05），也呈現一定的量效關系，表明秀珍菇多糖減輕了小鼠機體的脂質過氧化程度，延緩衰老。

·OH是機體內化學性質最活潑的一種活性氧[25]，能夠損傷細胞，引起衰老。過氧化氫是產生·OH的前體物質，CAT可以分解H2O2，減少·OH的產生，延緩衰老[26]。GSH-Px也是機體內一種重要的抗氧化酶，它特異性地催化GSH還原過氧化物的反應[27]。本實驗中，與模型對照組相比，秀珍菇多糖中、高劑量組小鼠肝臟和腦組織中的GSH-Px和CAT活力也均顯著提高（P＜0.01，P＜0.05），且活力隨著多糖質量濃度的升高而增大。表明秀珍菇多糖能夠將活性氧自由基和H2O2降解為無毒的H2O和O2，同時促使GSH將過氧化物還原，減少過氧化物量的產生，阻斷由過氧化物引發(fā)的自由基對機體組織造成的傷害，起到一定的抗衰老作用。

血液中ALT和AST活力是肝細胞受損的重要指標之一，肝細胞受損，ALT和AST便釋放入血液中，因此可以根據血清中ALT和AST活力的高低來判斷肝細胞的損傷程度[28]。ALT在肝臟中活力最高，AST在心臟中活力最高，其次是肝臟。ALT在肝臟中主要存在于肝細胞質內，AST在肝臟中主要存于肝細胞的線粒體內，當肝細胞受損時，其線粒體膜和細胞膜損傷，血液中ALT和AST活力明顯升高。ALP主要來自骨骼的成骨細胞和肝臟，當肝臟受到損傷時，ALP經淋巴道和肝竇進入血液，引起血清ALP的明顯升高[29-30]。本實驗中，模型組小鼠血清AST、ALT、ALP活力均比正常對照組明顯升高，表明D-半乳糖可致小鼠肝細胞受損，產生明顯的肝臟毒性，但灌胃不同劑量的秀珍菇多糖組小鼠血清AST、ALT、ALP活力均有所下降，表明肝臟毒性減輕，且毒性隨多糖劑量的升高而逐漸降低。

機體的免疫功能與衰老過程密切相關，細胞免疫功能低下是導致衰老的重要因素之一。胸腺與脾臟是機體兩種重要的免疫器官，胸腺指數與脾臟指數數值的高低能夠反映機體胸腺和脾臟免疫功能的狀況。與正常對照組相比，模型組D-半乳糖可導致小鼠胸腺和脾臟等免疫器官萎縮，胸腺組織和脾臟組織發(fā)生病理性改變，胸腺指數和脾臟指數降低。與模型組相比，秀珍菇多糖低、中、高劑量組小鼠的胸腺指數、脾臟指數顯著增加（P＜0.01，P＜0.05），表明PFP能夠抑制機體免疫器官的退化、增強機體的免疫能力。

本實驗研究結果表明，秀珍菇多糖能夠顯著提高D-半乳糖致衰老小鼠的肝臟指數和脾臟指數，增強肝、腦組織中的SOD、GSH-Px及CAT活力，降低肝、腦組織中的MDA含量，證明秀珍菇子實體多糖可顯著抑制D-半乳糖致衰老小鼠機體組織器官的退化，提高抗氧化酶活性、清除超氧陰離子自由基、清除·OH等活性氧。綜上所述，秀珍菇子實體多糖具有延緩衰老作用，其機制可能與其提高機體的抗氧化能力、增強機體的免疫功能有關，研究結果可為進一步開發(fā)和利用秀珍菇資源提供參考。

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Protective Effect of Polysaccharides from the Fruiting Body of Pleurotus geesteranus against D-Galactose-Induced Aging Mice

SUN Yujun1,2, JIANG Changjun3,*, REN Sihai4
(1. School of Life Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China; 2. College of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 3. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 4. Tobacco Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China)

The anti-aging effect of polysaccharides from the fruiting body of Pleurotus geesteranus (PFP) on a D-galactoseinduced aging mouse model. The aged mouse model was established by the injection of D-galactose. These mice were simultaneously administrated by gavage with PFP at different dosages for 42 days. At 12 h after the last administration, the activities of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px), and the contents of malondialdehyde (MDA) in serum, liver and brain were measured by using commercial reagent kits. The activities of serum aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatas (ALP) and alanine aminotransferase (ALT), and spleen and thymus indexes were also determined. The liver and brain were taken for histological analysis through HE staining. The results showed that PFP had antagonism effects on D-galactose-induced aging in mice, and could increase the activities of CAT, SOD and GSH-Px and reduce MDA levels in serum, and liver and brain tissues. Compared with the aging model group, the activities of serum AST, ALT, ALP in the medium- and high-dosage PFP group signif i cantly decreased (P < 0.05, P < 0.01) in parallel with a highly signif i cant increase in both spleen index and thymus index (P < 0.01). Histological sections showed that PFP displayed a signif i cant protective effect on liver and brain injury induced by D-galactose. In conclusion, PFP has signif i cant antioxidant and anti-aging effects. The underlying mechanism might be related to improving antioxidant function and enhancing immune function in the body.

10.7506/spkx1002-6630-201705041

S646.9

A

1002-6630（2017）05-0251-06

孫玉軍, 江昌俊, 任四海. 秀珍菇多糖對D-半乳糖致衰老小鼠的保護作用[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 251-256.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705041. http://www.spkx.net.cn

SUN Yujun, JIANG Changjun, REN Sihai. Protective effect of polysaccharides from the fruiting body of Pleurotus geesteranus against D-galactose-induced aging mice[J]. Food Science, 2017, 38(5): 251-256. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705041. http://www.spkx.net.cn

2016-06-21

安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目（KJ2014A052）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目（gxyqZD2016221）；安徽大學現代生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心2015年開放課題（BM2015004）

孫玉軍（1975—），男，教授，博士研究生，研究方向為食用菌多糖的功能。E-mail：sunyujun208@163.com

*通信作者：江昌俊（1957—），男，教授，碩士，研究方向為茶與食品生物技術。E-mail：jiangcj@ahau.edu.cn

Key words: Pleurotus geesteranus; polysaccharide; D-galactose; antioxidant; anti-aging