錢 葉，丁 祥，曾益春，伏 雷，朱洪慶，張 楠，侯萬儒，侯怡鈴,*

（1.西華師范大學生命科學學院，西南野生動植物資源保護省部共建教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000）

松乳菇多糖刺激免疫細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡的研究

錢 葉1，丁 祥1，曾益春2，伏 雷1，朱洪慶1，張 楠1，侯萬儒1，侯怡鈴1,*

（1.西華師范大學生命科學學院，西南野生動植物資源保護省部共建教育部重點實驗室，四川 南充 637009；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000）

為研究松乳菇多糖（Lactarius deliciosus Gray polysaccharide，LDG-A）對特異性免疫細胞的增殖效應活性及對腫瘤細胞凋亡的影響，在LDG-A作用下檢測T淋巴細胞、B淋巴細胞的增殖效應，并觀察T淋巴細胞、B淋巴細胞的細胞形態(tài)，檢測T淋巴細胞、B淋巴細胞在LDG-A的作用下處于細胞周期各個時期的細胞數(shù)量及B淋巴細胞分泌抗體的情況，觀察LDG-A作用于肺癌細胞A549的凋亡和細胞骨架情況。結果表明：隨著LDG-A質量濃度的增加，能夠促進T淋巴細胞、B淋巴細胞的增殖，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關系；同時LDG-A能夠減少T淋巴細胞、B淋巴細胞在G0/G1期的細胞數(shù)量百分比，促進細胞進入G2/M期，具有促進B淋巴細胞分泌抗體免疫球蛋白M、免疫球蛋白D和免疫球蛋白E的作用。在12.5～50.0 μg/mL范圍內(nèi)，LDG-A能夠誘導肺癌細胞A549凋亡，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關系；在細胞凋亡時F-肌動蛋白絲斷裂，蛋白纖維網(wǎng)絡結構被破壞。綜上所述，在體外實驗中，LDG-A對特異性免疫細胞具有促增殖效應活性，能夠促進腫瘤細胞的凋亡。

松乳菇多糖；免疫細胞；增殖效應；腫瘤細胞；凋亡

食藥用真菌多糖在國際上被稱為“生物反應調節(jié)劑”，一般是指從真菌的子實體和菌絲體所提取的代謝產(chǎn)物，是一類重要的生物活性成分[1]。近些年的研究表明，真菌多糖具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗病毒、延緩衰老、促進淋巴細胞增殖和免疫調節(jié)等多種生物功效[2-4]。

松乳菇（Lactarius deliciouss (L. ex Fr.) Gray），紅菇科乳菇屬，可與高山松馬尾等形成外生菌根菌[5]，是珍稀的野生食用菌[6]，被譽為“菌中王子”。任慧波[7]、Barros[8]等的研究表明，松乳菇胞外多糖具有明顯的抑菌作用，通過調動機體的抗應激能力、提高機體免疫功能和抗病防御機能，從而達到治療疾病的目的。邱美珍等[9]的研究表明，松乳菇菌絲多糖能提高小鼠的特異性免疫功能。松乳菇菌絲多糖能提高B淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的潛力，促進T淋巴細胞直接作用于靶細胞，使得小鼠的特異性免疫功能增強。但這些研究只針對松乳菇粗多糖，其精細結構并不清楚，導致相關分子機制的研究成為難點。

真菌多糖的活性與其結構有著密切的關系[10]，一般來說，真菌多糖的分子質量越大、支鏈的分支越多，其免疫調節(jié)能力和抗腫瘤活性就越強[11]。在本課題組前期的研究中，從200 g的松乳菇子實體中純化得到了水溶性的松乳菇多糖（Lactarius deliciosus Gray polysaccharide，LDG-A）430 mg，LDG-A的提取率為0.215%，其重均分子質量為11 003 D，并運用光譜學技術解析了其結構。結果顯示該多糖是由兩個單糖組成的雜多糖，即α-L-甘露糖和α-D-木糖以質量比3∶1的比例組成，具有（1→6）α-L-甘露糖的骨架，甘露糖的2-O上連接一個→3-α-D-木糖的側鏈[12]。陳楊瓊等[13]以不同劑量的LDG-A進行抗腫瘤活性研究，結果表明LDG-A在28 mg/kg時對腫瘤S180的抑瘤率為68.51%，在一定劑量LDG-A的作用下，對人喉癌Hep-2和人肝癌HepG-2都具有一定的抑制作用，并且在質量濃度為150 μg/mL時能顯著促進肝細胞增殖，表明LDG-A具有明顯的免疫調節(jié)活性和抗腫瘤活性。免疫調節(jié)活性一般通過對特異性免疫細胞的調控發(fā)揮作用，抗腫瘤活性一般通過直接誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮作用，但LDG-A究竟對哪些免疫細胞有影響，以及LDG-A誘導腫瘤細胞凋亡過程中對腫瘤細胞結構的影響仍需進一步深入研究。本實驗主要研究LDG-A對特異性免疫細胞的增殖效應活性及在腫瘤細胞凋亡過程中對細胞結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LDG-A由西華師范大學生命科學學院西南野生動植物資源保護省部共建教育部重點實驗室提供，制備方法參考文獻[12]；T淋巴細胞、B淋巴細胞、肺癌細胞A549 中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；細胞計數(shù)-8試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒 上海碧云天生物技術研究所；人免疫球蛋白M（immunoglobulin，IgM)、人IgD和人IgE酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海繼錦化學科技有限公司；膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶細胞凋亡試劑盒 杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；細胞骨架（肌動蛋白微絲、F-肌動蛋白）綠色熒光染色試劑盒 上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Epoch酶標儀 美國基因有限公司；DMI 3000倒置熒光顯微鏡、SP8激光掃描共聚焦顯微鏡 徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；Accuri C6流式細胞儀 碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；3100系列CO2恒溫培養(yǎng)箱美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 LDG-A作用于特異性免疫細胞

1.3.1.1 LDG-A對T淋巴細胞、B淋巴細胞的增殖效應

T淋巴細胞和B淋巴細胞為懸浮生長的細胞，采用CCK-8試劑盒對T淋巴細胞、B淋巴細胞形態(tài)和增殖進行檢測[14]。B淋巴細胞復蘇并用無酚紅培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期，更換培養(yǎng)液，并用培養(yǎng)液稀釋為2×105個/mL。實驗設置空白對照組、LDG-A實驗組和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）陽性對照組。用LDG-A配制終質量濃度為0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、15.00、20.00 μg/mL的溶液（LDG-A實驗組），LPS分別配制為：5 μg/mL（B淋巴細胞增殖LPS陽性對照組）、10 μg/mL（T淋巴細胞增殖LPS陽性對照組），每個質量濃度設6 個重復。向空白對照組、LDG-A實驗組、LPS陽性對照組中每孔加入100 μL細胞稀釋液，在37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在空白對照組中每孔加入100 μL細胞稀釋液、LDG-A實驗組按梯度每孔添加100 μL LDG-A配制液、LPS組中每孔加入100 μL LPS配制液，混勻。在37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后各孔添加CCK-8 10 μL，再培養(yǎng)3 h。用酶標儀在450 nm波長處測定各孔光密度（OD450nm）值并記錄實驗結果。OD值越高，說明細胞數(shù)量越多。

1.3.1.2 LDG-A對T、B淋巴細胞形態(tài)的影響

操作同1.3.1.1節(jié)，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察T、B淋巴細胞在LDG-A的作用后細胞形態(tài)。

1.3.1.3 LDG-A對T、B淋巴細胞周期的影響

T、B淋巴細胞均為懸浮生長的細胞，采用細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒對T、B淋巴細胞周期進行檢測[15]。T細胞周期實驗設置空白對照組、LDG-A實驗組（LDG-A 6.25、12.50、25.00 μg/mL）和陽性對照組（LPS 12.5 μg/mL）；B淋巴細胞周期實驗設置空白對照組、實驗組（LDG-A 0.5、1.0、10.0 μg/mL）和陽性對照組（LPS 5 μg/mL）；按照試劑盒所提供的實驗步驟準備細胞樣品，加入1 mL冰浴預冷的體積分數(shù)為70%的乙醇中，吹打混勻，4 ℃固定2 h。配制碘化丙啶染色液，以1 個樣品為例，染色緩沖液0.5 mL，（20×）碘化丙啶染色液25 μL，（50×）核糖核酸酶A 10 μL，終體積 0.535 mL。向每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。用流式細胞儀在激發(fā)波長為488 nm條件下檢測紅色熒光，并對處于各個細胞周期（G0/G1期、S期、G2/M期）的細胞數(shù)量百分比進行分析[16-17]。

1.3.1.4 LDG-A刺激B淋巴細胞分泌抗體的檢測

采用人IgM、IgD和IgE ELISA檢測試劑盒檢測LDG-A刺激下B淋巴細胞抗體的分泌。實驗設置空白對照組，實驗組（LDG-A 0.625、1.250、2.500、5.000 μg/mL）和陽性對照組（LPS 5 μg/mL），收集B淋巴細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒操作說明進行抗體檢測。用酶標儀在450 nm波長處測定各孔光密度（OD450nm）值，記錄實驗結果。

1.3.2 LDG-A誘導腫瘤細胞凋亡

1.3.2.1 LDG-A誘導肺癌細胞A549凋亡

肺癌細胞A549是貼壁生長的細胞，采用膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶細胞凋亡試劑盒檢測LDG-A誘導肺癌細胞A549凋亡[18]。實驗設置空白對照組、LDG-A實驗組（LDG-A 12.5、25、50 μg/mL）和陽性對照組（LPS 10 μg/mL），按照試劑盒所提供的實驗步驟進行肺癌細胞A549凋亡檢測。肺癌細胞A549經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌、胰酶消化、室溫孵育、離心（1 000×g、5 min）后收集細胞，用PBS重懸細胞并計數(shù)。取數(shù)量為5～10萬個重懸的細胞，1 000×g離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞。依次加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶染色液并混勻，室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。1 000×g離心5 min，收集細胞，50～100 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，涂片后，在激光掃描共聚焦顯微鏡[19]下觀察肺癌細胞A549凋亡的情況。

1.3.2.2 肺癌細胞A549細胞骨架觀察

肺癌細胞A549分別用等量的培養(yǎng)液、LDG-A和LPS進行培養(yǎng)，設置空白對照組、LDG-A實驗組（LDG-A 10 μg/mL）和陽性對照組（LPS 10 μg/mL），采用細胞骨架綠色熒光染色試劑盒進行細胞骨架實驗[20]。配制染色工作液，置于暗室中的冰槽備用。接種待測細胞培養(yǎng)，直至每孔鋪滿率達70%。按照試劑盒所提供的操作步驟，分別添加試劑處理細胞，使細胞充分染色。封片后，即刻在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行觀察，在激發(fā)波長488 nm、散發(fā)波長530 nm條件下，F(xiàn)-肌動蛋白顯示綠色熒光。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 LDG-A作用于特異性免疫細胞

2.1.1 LDG-A對T淋巴細胞增殖的影響

T淋巴細胞由骨髓中的造血干細胞遷移到胸腺內(nèi)分化成熟，成為具有免疫活性的T淋巴細胞。成熟的T淋巴細胞能與靶細胞特異性結合，直接殺傷靶細胞，或釋放淋巴因子，使得免疫效應增強，主要參與機體的細胞免疫。

圖 1 LDG-A對T淋巴細胞增殖的影響Fig. 1 Effect of LDG-A on the proliferation of T cells

由圖1可知，當LDG-A 的質量濃度為0.25～20 μg/mL時，均能夠顯著促進T淋巴細胞的增殖，與空白對照組相比具有極顯著性差異 （P＜0.01）。LDG-A的質量濃度為0.25～15 μg/mL時，其質量濃度與促進T淋巴細胞增殖的效應呈正相關。值得注意的是，當LDG-A質量濃度為20 μg/mL時，雖然增殖效應顯著，但增殖效應相對于在15 μg/mL時略有下降。由此可得，當LDG-A的質量濃度在0.25～20 μg/mL范圍內(nèi)，T淋巴細胞的增殖效應的最適質量濃度為15 μg/mL。綜上結果顯示，LDG-A在細胞免疫方面具有免疫增強作用。

2.1.2 LDG-A對T淋巴細胞形態(tài)的影響

由圖2可知，正常狀態(tài)下，T淋巴細胞呈圓球形，極易成團生長。在倒置熒光顯微鏡下觀察T淋巴細胞，細胞狀態(tài)良好，細胞形態(tài)沒有明顯變化。隨著LDG-A質量濃度的增加，單位視野內(nèi)T淋巴細胞數(shù)量逐漸增加并呈分散生長，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關系，當LDG-A質量濃度為15 μg/mL時T淋巴細胞狀態(tài)和增殖效果最好。

2.1.3 LDG-A對T淋巴細胞周期的影響

細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束，有間期和分裂期兩個階段。G0期是指具有分裂能力的細胞在連續(xù)分裂數(shù)次之后處于停滯狀態(tài)的時期。間期又分為G1期、S期和G2期。G1期為DNA合成的準備期；S期主要進行DNA的合成，除此之外還合成DNA復制所需要的酶；G2期是有絲分裂準備期，主要完成蛋白質的合成。M期即細胞分裂期。細胞周期從G0/G1期進入S期是細胞增殖的前提和準備，通過促進細胞從G0/G1期進入S期，細胞的增殖作用增強，細胞分裂更加旺盛，即通過改變細胞周期，使細胞分裂更加旺盛，促進細胞增殖[22]。

LDG-A對T淋巴細胞周期的影響實驗，結果如圖3所示，與空白對照組相比，當LDG-A的質量濃度為6.25～25 μg/mL時，T淋巴細胞處于G0/G1期的細胞數(shù)量百分比與LDG-A質量濃度呈負相關，而處于G2/M期所占細胞數(shù)量百分比與LDG-A質量濃度呈正相關，表明T淋巴細胞在一定質量濃度的LDG-A刺激下細胞周期發(fā)生改變，在G0期的停止時間和G1期的準備時間減少，G2期和細胞分裂期（M期）的細胞數(shù)量百分比增加，即T淋巴細胞分裂能力增強。綜上，LDG-A可以作為T淋巴細胞有絲分裂原，促進T細胞從G0/G1期進入G2/M期，使得T淋巴細胞增殖作用增強，具有促增殖作用。2.1.4 LDG-A對B淋巴細胞增殖效應的影響

B淋巴細胞由哺乳動物骨髓或鳥類法氏囊中的造血干細胞分化發(fā)育而來。在抗原的刺激下，B淋巴細胞分化成漿細胞，由漿細胞合成和分泌抗體，執(zhí)行體液免疫功能。

圖 4 LDG-A對B淋巴細胞增殖的影響Fig. 4 Effect of LDG-A on the proliferation of B cells

由圖4可知，當LDG-A的質量濃度為0.25～20 μg/mL時，均能夠顯著促進B淋巴細胞的增殖，與空白對照組相比具有極顯著性差異（P＜0.01），并且LDG-A的質量濃度與促進B淋巴細胞增殖的效應呈正相關，當LDG-A質量濃度為20 μg/mL時B淋巴細胞增殖效應最好，即LDG-A在體液免疫方面具有免疫增強作用。

2.1.5 LDG-A對B細胞形態(tài)的影響

圖 5 LDG-A對B淋巴細胞形態(tài)的影響Fig. 5 Effect of LDG-A on B cell morphology

由圖5可知，正常狀態(tài)下，B淋巴細胞呈規(guī)則的圓形，明顯的集簇生成。在倒置熒光顯微鏡下觀察B淋巴細胞，細胞狀態(tài)良好，細胞形態(tài)無顯著變化。隨著LDG-A質量濃度的增加，單位視野內(nèi)B淋巴細胞數(shù)量增加并逐漸分散開來，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關系，當LDG-A的質量濃度為20 μg/mL時B淋巴細胞狀態(tài)和增殖效果最好。

2.1.6 LDG-A對B淋巴細胞周期的影響

圖 6 LDG-A對B淋巴細胞周期影響的統(tǒng)計學分析Fig. 6 Statistical analysis of the effect of LDG-A on the cell cycle distribution of B cells

LDG-A對B淋巴細胞周期的影響實驗，結果如圖6所示。與空白對照組相比，當LDG-A的質量濃度為0.5～10 μg/mL時，B淋巴細胞處于G0/G1期的細胞數(shù)量百分比與LDG-A質量濃度呈負相關，而處于S期和G2/M期所占細胞數(shù)量百分比與LDG-A質量濃度呈正相關，表明B淋巴細胞在一定質量濃度的LDG-A刺激下，B淋巴細胞的細胞周期發(fā)生改變，在G0期的停止時間和G1期的準備時間減少，相應的細胞數(shù)量百分比也就減少，而處于S期、G2期和細胞分裂期（M期）的細胞數(shù)量百分比增加，即B淋巴細胞分裂能力增強，當LDG-A的質量濃度為10 μg/mL時效果最好。即LDG-A能夠促進B淋巴細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期，從而使得B細胞增殖作用增強，具有促增殖作用。

2.1.7 LDG-A對B淋巴細胞分泌抗體的影響

圖 7 LDG-A對B淋巴細胞分泌抗體的影響Fig. 7 Effect of LDG-A on the secretion of antibody from B cells

當機體受到病原體的侵害時，病原體的抗原刺激T淋巴細胞產(chǎn)生淋巴因子，B淋巴細胞在的抗原的刺激和淋巴因子的作用下，增殖、分化為漿細胞，合成和分泌抗體（免疫球蛋白），執(zhí)行體液免疫功能。本實驗檢測了在LDG-A的刺激下B淋巴細胞分泌IgM、IgD和IgE的情況，結果如圖7所示，LDG-A在質量濃度為0.625～5 μg/mL時，均能刺激B淋巴細胞分泌IgM、IgD和IgE，并且均與LDG-A的質量濃度呈正相關，值得注意的是，LDG-A在質量濃度為0.625～5 μg/mL范圍內(nèi)，IgM和IgE抗體水平與空白對照組相比均具有極顯著差異（P＜0.01），其中，LDG-A質量濃度為5 μg/mL時，IgM、IgD和IgE的促分泌效果最好。

2.2 LDG-A誘導腫瘤細胞凋亡

2.2.1 LDG-A誘導肺癌細胞A549凋亡

細胞凋亡是指為維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制，細胞發(fā)生自主的、有序性的死亡。細胞凋亡在形態(tài)學上共分為3 個階段，第1階段是凋亡的起始階段，在這一階段細胞體積收縮，細胞連接消失，染色質逐漸濃縮凝聚成新月狀附于核膜周圍；第2階段形成凋亡小體；第3階段凋亡小體被鄰近的細胞吞噬及消化[23]。何雅軍等[18]的研究表明，Annexin V-FITC/PI雙標記染色可以準確反映細胞凋亡的過程，可作為檢測細胞凋亡早期的方法。本實驗所用試劑為膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶細胞凋亡試劑盒，與Annexin V-FITC/PI雙標記染色作用機理類似，故可以檢測肺癌細胞A549凋亡早期的過程。肺癌細胞A549的細胞形態(tài)呈上皮細胞樣，是貼壁生長的細胞。

在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察LDG-A誘導肺癌細胞A549凋亡，可以觀察到肺癌細胞A549體積收縮，染色質逐漸濃縮凝聚成新月狀附于核膜周邊，呈現(xiàn)出細胞凋亡的一般形態(tài)。當LDG-A的質量濃度為12.5～50 μg/mL時，LDG-A能夠誘導肺癌細胞A549凋亡，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關系，肺癌細胞A549凋亡的程度與LDG-A的質量濃度呈正相關。當LDG-A的質量濃度為50 μg/mL時，其促進肺癌細胞A549凋亡的效果最好。結果表明，LDG-A能夠誘導肺癌細胞A549凋亡（圖8）。

圖 8 LDG-A誘導肺癌細胞A549凋亡Fig. 8 A549 cell apoptosis induced by LDG-A

2.2.2 肺癌細胞A549細胞骨架觀察

細胞骨架是真核細胞中的蛋白質纖維網(wǎng)架結構，它不僅能維持細胞形態(tài)，保持細胞內(nèi)部結構的有序性，而且還參與許多重要的生命活動。Chad等[20]的研究表明，細胞凋亡時細胞骨架形態(tài)會發(fā)生改變，包括細胞骨架網(wǎng)狀結構的凝聚、降解和分布不均等。有研究表明，細胞凋亡時，細胞骨架形態(tài)變化的一個典型特征就是F-肌動蛋白細絲斷裂，肌動蛋白網(wǎng)狀結構破壞。

在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察LDG-A誘導肺癌細胞A549凋亡的細胞骨架，與空白對照組相比，可以觀察到在細胞凋亡時F-肌動蛋白絲發(fā)生斷裂，蛋白纖維網(wǎng)絡結構遭到破壞，但作用效果沒有陽性對照組明顯。表明細胞骨架改變是細胞凋亡形態(tài)學改變的基礎，即細胞骨架結構改變使得活細胞的結構形態(tài)和生理功能發(fā)生改變，細胞失去原有的活性，從而導致細胞凋亡（圖9）。

圖 9 肺癌細胞A549骨架觀察Fig. 9 Cytoskeleton of A549 cells

3 討 論

多糖制劑作為抗腫瘤藥物，不像一般藥物直接殺傷腫瘤細胞，而是作為免疫調節(jié)劑，通過促進機體的特異性免疫功能，達到抑制和消滅腫瘤細胞的效果[24]。大量的研究表明，真菌多糖的抗腫瘤免疫機制是通過激活T、B淋巴細胞等免疫細胞，提高機體免疫力來抑制腫瘤細胞的生長，甚至是直接誘導腫瘤細胞凋亡[25-26]。本實驗結果顯示，LDG-A雖然能夠誘導肺癌細胞A549凋亡，但肺癌細胞A549骨架觀察結果顯示，在LDG-A作用下，F(xiàn)-肌動蛋白絲發(fā)生斷裂的情況沒有陽性對照組明顯，提示LDG-A可能主要通過作用于特異性免疫細胞來抑制腫瘤細胞的生長。

LPS可以誘導B淋巴細胞產(chǎn)生抗體，從而介導機體的體液免疫機制[27]；同時，LPS也能刺激T淋巴細胞增殖[28]。本實驗研究了LDG-A對T、B淋巴細胞的增殖效應及細胞形態(tài)的影響，結果表明，T、B淋巴細胞的促增殖效應與LDG-A的質量濃度呈正相關，細胞狀態(tài)良好?；趦煞N特異性免疫細胞的差異，不同質量濃度的LDG-A顯示出不同的促增殖效應。研究表明，在細胞的增殖過程中，G0/G1期的細胞百分比明顯降低，而S期或G2/M期細胞百分比增加[29]。本實驗研究了LDG-A對T、B細胞周期的影響，結果表明，在一定質量濃度范圍內(nèi)，LDG-A能夠降低B淋巴細胞在G0/G1期的細胞數(shù)量百分比，促進B淋巴細胞進入S期和G2/M期，從而促進B淋巴細胞增殖；同時，LDG-A也能夠降低T淋巴細胞在G0/G1期的細胞數(shù)量百分比，促進T淋巴細胞進入G2/M期，繼而促進T淋巴細胞增殖。

免疫球蛋白作為機體中具有生物活性的物質，在防止細菌入侵、抗病毒、增強機體免疫力、活化補體、殺傷腫瘤細胞等方面起到重要作用[29]，是機體的重要防御機制[30]。機體接受抗原刺激后首先產(chǎn)生抗體IgM，在一定程度上抵抗外源性刺激對機體的傷害[31]。本實驗中LDG-A可以作為B淋巴細胞有絲分裂原，通過促進B淋巴細胞增殖，誘導B淋巴細胞產(chǎn)生抗體IgM、IgD和IgE，從而介導機體的體液免疫，增強機體的特異性免疫。

綜上所述，在體外實驗中LDG-A對特異性免疫細胞具有促增殖效應活性，且能夠誘導腫瘤細胞的凋亡，但涉及的相關信號轉導通路與分子機制還有待進一步驗證。

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Polysaccharide from Lactarius deliciosus Gray Stimulates Immunocyte Proliferation and Induces Tumor Cells Apoptosis

QIAN Ye1, DING Xiang1, ZENG Yichun2, FU Lei1, ZHU Hongqing1, ZHANG Nan1, HOU Wanru1, HOU Yiling1,*
(1. Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation, Ministry of Education, College of Life Science, China West Normal University, Nanchong 637009, China; 2. Sericultural Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Nanchong 637000, China)

To understand the effect of Lactarius deliciosus Gray polysaccharide (LDG-A) on the proliferation of specif i c immunocytes and tumor cell apoptosis, we tested and observed the proliferation and morphological changes of T lymphocytes and B lymphocytes in the presence of LDG-A, determined the number of T lymphocytes and B lymphocytes in each stage of the cell cycle, and also evaluated antibody secretion by B lymphocytes under the stimulation of LDG-A. In addition, the apoptosis and cytoskeleton of lung cancer cell A549 were evaluated. The results showed that the proliferation of B lymphocytes and T lymphocytes’ proliferation was promoted LDG-A in a dose-response manner. LDG-A could also reduce the number of B lymphocytes at the G0/G1phase and promote them to enter the G2/M phase. Meanwhile, LDG-A also promoted the secretion of IgM, IgD and IgE by B lymphocytes. In addition, LDG-A in the range of 12.5–50.0 μg/mL could induce the apoptosis of lung cancer cell A549 in a dose-dependent manner. Moreover, we observed fractured F-actin fi laments in the cells as well as damaged protein fi ber networks during apoptosis. In conclusion, LDG-A has a promoting effect on the proliferation of specif i c immunocytes, and accelerates the apoptosis of tumor cells in vitro.

L. deliciosus Gray polysaccharide; immunocyte; proliferation activity; tumor cells; apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201705036

Q939.91

A

1002-6630（2017）05-0220-07

錢葉, 丁祥, 曾益春, 等. 松乳菇多糖刺激免疫細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡的研究[J]. 食品科學, 2017, 38(5):

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QIAN Ye, DING Xiang, ZENG Yichun, et al. Polysaccharide from Lactarius deliciosus Gray stimulates immunocyte proliferation and induces tumor cells apoptosis[J]. Food Science, 2017, 38(5): 220-266. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705036. http://www.spkx.net.cn

2016-03-06

國家自然科學基金青年科學基金項目（31400016）

錢葉（1993—），女，碩士研究生，主要從事資源微生物研究。E-mail：937614129@qq.com

*通信作者：侯怡鈴（1983—），女，教授，博士，主要從事生物化學與分子生物學研究。E-mail：starthlh@126.com