唐國冬，田 雨，王 倩，楊繼紅,,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄與葡萄酒（合陽）試驗站，陜西 合陽 715300）

低溫處理對葡萄果皮細胞結(jié)構(gòu)的影響

唐國冬1，田 雨2，王 倩2，楊繼紅1,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄與葡萄酒（合陽）試驗站，陜西 合陽 715300）

目的：通過研究低溫處理對葡萄果皮細胞結(jié)構(gòu)的影響，揭示其影響葡萄酒品質(zhì)的內(nèi)在機制。方法：分別對戶太八號、赤霞珠葡萄果粒進行4、－8、－20、－32 ℃和液氮低溫處理，電子顯微鏡觀察果皮細胞的結(jié)構(gòu)變化，并檢測果實酚類物質(zhì)和香氣成分含量。結(jié)果：果皮細胞經(jīng)4 ℃處理后，無明顯變化；－8 ℃處理后，出現(xiàn)質(zhì)壁分離，析出單寧、淀粉等結(jié)晶體；－20 ℃處理后，細胞嚴(yán)重變形，胞內(nèi)物質(zhì)混亂模糊，細胞膜系統(tǒng)出現(xiàn)裂痕，單寧等后含物增多；－32 ℃和液氮處理后，細胞壁、膜結(jié)構(gòu)破壞更完全。結(jié)果表明：低溫處理能夠使果皮細胞溶出更多的單寧、總酚、總花色苷和香氣物質(zhì)，且在不同溫度條件下處理其含量有顯著性差異，其中－8、－20、－32 ℃處理后細胞溶出結(jié)果最顯著；4 ℃、液氮處理不能溶出香氣成分。結(jié)論：低溫處理破壞了細胞結(jié)構(gòu)，加快了酚類物質(zhì)、芳香物質(zhì)的溶出，有利于提高葡萄汁的品質(zhì)。

葡萄；低溫處理；果皮細胞；電子顯微鏡觀察；葡萄酒品質(zhì)

影響葡萄酒質(zhì)量的酚類物質(zhì)、芳香物質(zhì)等重要成分主要存在于葡萄果皮中。酚類物質(zhì)是構(gòu)成葡萄固體部分的主要物質(zhì)之一，多存在于葡萄果皮細胞的細胞壁及下表皮細胞液泡中[1-2]，常見的種類有花色素、單寧、黃酮類、酚酸類等?；ㄉ厥怯幸嫒祟惤】礫3]的物質(zhì)，一般存在于葡萄表皮細胞的液泡中[4]，其濃度是果肉細胞的4～8 倍[5]，隨細胞破裂迅速進入葡萄汁中[6]，直接影響葡萄和葡萄酒的顏色、葡萄酒的感官屬性與香味物質(zhì)[7]。單寧在葡萄酒中具有沉淀蛋白質(zhì)、穩(wěn)定色素、抗氧化、抗菌等作用，同時還能防止還原味和光味的產(chǎn)生[8]，進一步影響葡萄酒的口感和顏色[9-10]。白藜蘆醇、槲皮素等屬于類黃酮物質(zhì)，一般也存在于葡萄果皮中，具有強抗氧化和抗自由基功能，可延緩腫瘤生長達到防治癌癥的作用[11]，具有良好的防治心血管疾病的功效[12]。葡萄果實的芳香物質(zhì)主要是酯類、醛類、萜烯類等化合物，決定著葡萄[13]、葡萄酒的香氣類型[14]，影響葡萄酒的風(fēng)味和典型性[15]，一般存在于果皮細胞[16]及其液泡中[17]。因此，有效提取葡萄果皮中的酚類和芳香類物質(zhì)是釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒的關(guān)鍵。

通過低溫脅迫、冷凍損傷機理形成的凍害[18]或冰晶[19]可以破壞果皮細胞的細胞壁和細胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，使細胞內(nèi)的物質(zhì)成分流到胞外，此過程中發(fā)生的物理、化學(xué)變化還有可能加速酶的反應(yīng)，使酶更易與底物作用[20]。研究表明，低溫處理葡萄果實不但可以提高出汁率，而且?guī)缀醪粨p失葡萄皮的揮發(fā)性物質(zhì)成分[21]，還能浸提出更多對葡萄酒品質(zhì)起決定作用的物質(zhì)，如香氣成分[22]和酚類物質(zhì)[23-24]。

戶太八號和赤霞珠果皮中都含有較多的酚類和香氣物質(zhì)，且在果皮厚度及果皮與果肉分離程度上很相似。光學(xué)顯微鏡下觀察戶太八號果皮細胞可以從顯微結(jié)構(gòu)宏觀地觀察到細胞層次、整體形態(tài)的變化，再通過透射電子顯微鏡觀察相同處理的赤霞珠果皮細胞能夠從亞顯微結(jié)構(gòu)觀察細胞超微結(jié)構(gòu)[25]、細胞形態(tài)、層次排列及破損程度等，并檢測葡萄汁中的酚類物質(zhì)和香氣成分含量。實驗通過分析不同低溫處理后葡萄果皮細胞結(jié)構(gòu)和理化指標(biāo)的變化，明確不同溫度處理對葡萄果皮細胞內(nèi)重要物質(zhì)溶出程度的影響，以期為低溫冷凍處理在葡萄汁及葡萄酒加工中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：赤霞珠采自河北昌黎華夏酒莊葡萄示范園；戶太八號采自陜西戶縣果樹研究所葡萄示范園。

戊二醛（含量50%，電子顯微鏡專用）、甲基纖維素 上海麥克林生化科技有限公司；黃膠（USP級）阿拉丁試劑有限公司；鋨酸（純度99.8%） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、無水丙酮、沒食子酸（均為分析純） 廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；鹽酸（含量35%）、甲醇、碳酸鈉、氯化鉀、無水乙酸鈉（均為分析純） 廣東光華科技股份有限公司；兒茶素（含量≥90%） 南京都萊生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HT7700型透射電子顯微鏡（配有電子顯微鏡圖像管理軟件及渦輪分子泵真空系統(tǒng)） 日本日立高新技術(shù)公司；BX52＋DP72型生物顯微鏡（配有專業(yè)顯微數(shù)碼CCD DP72攝50C系統(tǒng)） 日本奧林巴斯株式會社；Trace GC ultra-Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有TurboMatrix 350熱解析儀、DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25?μm）及2002版NIST質(zhì)譜譜庫）美國Finnigan公司；CM3050s型冷凍切片機 德國Leica公司；UV-60紫外-可見光分光光度計 美國安捷倫公司；DW-FL362型－40 ℃低溫冷凍冰箱 安徽中科美菱公司；4 ℃醫(yī)用冷藏冰箱 山東澳柯瑪公司；HH147U型四通道數(shù)顯溫度計 美國Omega公司；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機有限公司；FD-IC-50型低溫真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品冷凍處理

揀選成熟度好的葡萄果粒，分為6 組，每組選用200～300 粒，以16 ℃為對照，分別在4、－8、－20、－32 ℃及液氮狀態(tài)下進行低溫處理，當(dāng)溫度分別降至設(shè)定溫度后，立即取出處理好的葡萄，迅速移至冷藏室解凍至4 ℃，全程記錄葡萄果粒中心溫度變化情況。

1.3.2 顯微鏡觀察

1.3.2.2 光學(xué)顯微鏡觀察

使用冷凍切片機將樣品制成超薄切片，用光學(xué)顯微鏡觀察細胞及組織的整體形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，并拍照記錄。

1.3.2.2 透射電子顯微鏡觀察前處理

制樣：選取冷凍處理后的葡萄果粒5～6 顆，撕下果皮，用刀片將果皮切成2 mm×3 mm的樣品塊，分別制作5 個樣品小塊，并將樣品塊置于含有2 mL 4%戊二醛的5 mL離心管中，4 ℃條件下保存過夜。

漂洗及鋨酸固定：除凈樣品表面的戊二醛，磷酸鹽緩沖液沖洗樣品塊5 次，每次15 min。加入0.5 mL鋨酸，放置1.5～2.0 h，再用磷酸鹽緩沖液進行漂洗5 次，步驟同上。

脫水：分別用不同體積分?jǐn)?shù)梯度的乙醇溶液對樣品塊依次進行脫水操作。30%、50%乙醇溶液分別浸泡15 min脫水，再用70%乙醇溶液脫水，靜置過夜后80%、90%乙醇溶液分別依次脫水15 min，再用100%乙醇溶液浸泡30 min，最后用100%丙酮溶液浸泡30 min并平行操作3 次。

滲透：丙酮與黃膠體積比為3∶1、1∶1、1∶3條件下加入2 mL丙酮溶膠進行滲透操作，處理時間依次為1.5、3.0、2.0 h。再以純黃膠分別滲透2 次，每次24 h。

包埋：將處理后的樣品塊放入填滿膠體的包埋板中，膠塊中沒有氣泡且膠體表面水平。將包埋板分別放置在30 ℃和60 ℃的干燥箱中依次干燥24 h和48 h。然后進行冷凍切片、染色和觀察。

1.3.2.3 透射電子顯微鏡觀察

應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察樣品細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，進樣后調(diào)節(jié)觀察視野及清晰度。對成像效果拍照前，需要調(diào)整亮度使整個界面變暗，以保護內(nèi)部的攝像和成像設(shè)備。

1.3.3 葡萄皮中總酚、單寧、總花色苷含量測定

剝?nèi)∑咸哑げ⒂靡旱鋬龇鬯槌煞勰?，插入?nèi)容：在－50 ℃超低溫真空凍干機上凍干24 h成干粉。取1 g干粉、20 mL鹽酸-甲醇溶液（60%甲醇、0.1%鹽酸）于50 mL離心管中30 ℃超聲功率40 W提取30 min，4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min后收集上清液，重復(fù)2 次上述步驟并定容60 mL，整個過程避光操作。甲基纖維素法測定葡萄中單寧含量，結(jié)果以兒茶素計（mg/g）；福林-肖卡法測定葡萄中總酚含量，結(jié)果以沒食子酸計（mg/g）；pH示差法測定葡萄中總花色苷含量，結(jié)果以二甲花翠素葡萄糖苷計（mg/g）。

1.3.4 葡萄皮中香氣成分測定

取20 g葡萄剝?nèi)∑咸哑?，用模擬葡萄汁（用酒石酸調(diào)純凈水pH 3.5）定量20 g于小密封瓶中，冰水浴超聲波提取20 min，4 ℃、8 000 r/min離心后取10 mL上清液、加入2 g的NaCl、50?μL的2-辛醇內(nèi)標(biāo)物和攪拌子于50 mL密封瓶，在磁力攪拌器上振蕩1 h后氣相色譜-質(zhì)譜測定樣品。

Turbo Matrix 350 ATD分析條件：以He為載氣，脫附流速設(shè)為45 mL/min，加熱閥溫度設(shè)為245 ℃，脫附管溫度為270 ℃，脫附15 min。傳輸線溫度為255 ℃。冷阱捕集溫度設(shè)為－30 ℃，以40 ℃/min升至255 ℃（二級解吸冷阱溫度）。出口分流比為3∶1，進樣He流速為1 mL/min。

GC條件：色譜柱DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）以He為載氣，流速設(shè)為1 mL/min。柱溫升溫程序為40 ℃保持3 min，隨后以4 ℃/min的速率升至160 ℃，7 ℃/min至230 ℃，在此溫度條件下保持8 min。連接桿溫度設(shè)為230 ℃。

MS條件：全掃描，范圍為33～450 u，每秒掃描1 次。以EI＋為電離源，離子源溫度設(shè)為230 ℃，電子能量設(shè)為70 eV，燈絲流量設(shè)為0.2 mA，檢測器電壓350 V。

數(shù)據(jù)圖譜分析：實驗數(shù)據(jù)處理由Xcalibur軟件系統(tǒng)完成。揮發(fā)性物質(zhì)（含酸類、醇類和酯類物質(zhì)）的定性：未知化合物經(jīng)計算機檢索同時與 NIST2002譜庫相匹配。用峰面積歸一法和內(nèi)標(biāo)物2-辛醇來定量計算出各化學(xué)成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠葡萄冷凍及解凍溫度曲線

圖 1 赤霞珠葡萄冷凍及回溫曲線圖Fig. 1 Freezing and thawing curves of Cabernet Sauvignon grapes

如圖1所示，將常溫條件下的赤霞珠果實降溫至4、－8、－20、－32 ℃，低溫冷凍冰箱設(shè)定溫度分別為：4、－8、－20、－32 ℃，低溫處理時間分別為5.5、6.0、9.5、10.5 h；－8、－20、－32 ℃處理回溫至4 ℃時間分別為6.5、7.5、9.5 h；液氮處理是瞬間降溫過程，回溫到4 ℃時間僅為5.0 h。葡萄初始溫度16 ℃與低溫冷凍冰箱設(shè)定的溫度差越大，降溫速度越快；當(dāng)葡萄溫度接近設(shè)定溫度時，降溫速度減慢。

2.2 溫度對戶太八號葡萄果皮細胞結(jié)構(gòu)的影響

圖 2 溫度對戶太八號葡萄果皮細胞結(jié)構(gòu)的影響（×20）Fig. 2 Observation of the effect of cryogenic treatment on the structure of ‘Hutai No. 8’ grape skin cells under optical microscope (× 20)

圖2為光學(xué)顯微鏡放大20 倍（1∶50 nm）下觀察冷凍切片處理后的戶太八號葡萄果皮細胞結(jié)構(gòu)。4 ℃處理的漿果細胞層次清晰，表皮整齊緊湊，細胞形態(tài)完整；－8 ℃處理的漿果細胞層次略微混亂，由于物質(zhì)外滲使得細胞邊界模糊，但細胞形態(tài)較為完整；－20 ℃處理的果皮細胞排列出現(xiàn)斷層，依舊可以看出細胞的大體形態(tài)，部分細胞細胞邊界不可辨；－32 ℃處理的漿果表皮細胞更為清晰地顯示了細胞層的斷裂，表皮結(jié)構(gòu)排列無規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，細胞邊界不可辨。結(jié)果表明：處理溫度越低，葡萄果皮細胞的斷裂程度越大。

2.3 溫度對赤霞珠葡萄果皮細胞結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 細胞壁完整性比較

圖 3 溫度對赤霞珠葡萄果皮細胞結(jié)構(gòu)的影響（×3 000）Fig. 3 Observation of the effect of cryogenic treatment on the structure of Cabernet Sauvignon grape skin cells under transmission electron microscope (×3 000)

如圖3a、b所示，16、4 ℃條件下葡萄果皮細胞壁結(jié)構(gòu)完整，沒有損傷；－8 ℃條件下細胞壁有輕微變形，沒有破損（圖3c）；－20 ℃（圖3d）和－32 ℃（圖3e）處理后細胞壁扭曲變形，少數(shù)位置出現(xiàn)斷裂，無法維持細胞形狀；液氮處理（圖3f）的樣品細胞壁斷裂。

2.3.2 質(zhì)壁分離比較

圖3表明，對照組葡萄果皮16 ℃沒有質(zhì)壁分離，4 ℃有輕微質(zhì)壁分離，－8、－20、－32 ℃、液氮處理后葡萄果皮質(zhì)壁分離越來越明顯，液氮處理質(zhì)壁分離最顯著。

2.3.3 細胞液泡及膜完整性比較

通過電子顯微鏡觀察，16、4 ℃（圖3a、b）條件下葡萄果皮細胞液泡完整，沒有損傷。－8 ℃（圖4a）處理，液泡膜僅個別位置出現(xiàn)少許斷裂，但基本維持其形狀未改變；－20 ℃（圖3d、圖4c）處理，液泡膜斷裂呈片段狀甚至部分消失，液泡受損嚴(yán)重；－32 ℃和液氮處理（圖3e、f），液泡膜多處斷裂甚至消失，液泡失水嚴(yán)重，細胞明顯變形。

2.3.4 細胞器完整性比較

16、4、－8 ℃處理（圖3a、b、c）葡萄果皮細胞器完整，沒有損傷；－20 ℃（圖4c）處理細胞內(nèi)多種細胞器解體但仍有少許細胞器完整；－32 ℃處理（圖3e）未觀察到完整的細胞器，但有部分細胞器仍能分辨；液氮處理后細胞器無法分辨，幾乎所有細胞內(nèi)容物消失。

2.3.5 細胞變形性及暴露的后含物比較

16 ℃對照組（圖3a）的葡萄漿果細胞具有完整的細胞結(jié)構(gòu)，液泡飽滿且細胞質(zhì)分布均勻，細胞器的形態(tài)非常完整清晰；4 ℃處理（圖3b）的果皮細胞結(jié)構(gòu)比較完整，細胞壁和細胞膜完好，細胞器形態(tài)完整清晰；－8 ℃處理（圖4a）已經(jīng)有較為明顯的質(zhì)壁分離，有明顯的物質(zhì)通過通道，部分位置的細胞膜、胞內(nèi)膜尤其是液泡膜有較為嚴(yán)重的斷裂，細胞壁上未出現(xiàn)較明顯的裂痕，細胞器形態(tài)依舊保持完整且清晰；－20 ℃處理（圖3d）能明顯看到更嚴(yán)重的質(zhì)壁分離，細胞壁和細胞膜斷裂增多甚至部分消失；細胞變形嚴(yán)重，失去固有形狀，但是仍有部分細胞器（如葉綠體、線粒體）保持完整性；－32 ℃處理（圖3e）的果皮細胞內(nèi)容物幾乎混為一團，細胞內(nèi)沒有完整的細胞器，細胞壁上的斷裂也更為嚴(yán)重并出現(xiàn)扭曲斷裂，質(zhì)壁分離更為嚴(yán)重，細胞形變加??；液氮處理（圖3f）的果皮細胞內(nèi)的物質(zhì)完全混為一團，細胞內(nèi)沒有完整的細胞器或結(jié)構(gòu)，細胞壁扭曲斷裂甚至消失，細胞失去形態(tài)。

圖3表明，16 ℃對照組和4 ℃處理沒有觀察到結(jié)晶后含物；－8 ℃出現(xiàn)了較少的單寧結(jié)晶、淀粉螺旋（圖4b）及過氧化氫酶體；－20 ℃處理能清晰觀察到葡萄果皮細胞中數(shù)量較多、體積較大的后含物（圖4c），主要是淀粉粒、糊粉粒（貯藏蛋白質(zhì)）、單寧晶體等，它們在細胞質(zhì)中混存的范圍、間隙變大，還可觀察到較多的過氧化物酶體；－32 ℃及液氮處理能夠觀察到數(shù)量多但體積小的后含物。

圖 4 透射電子顯微鏡觀察圖Fig. 4 Observation under transmission electron microscope

綜上可知，溫度越低，細胞破壞程度越大，細胞變形性、質(zhì)壁分離、細胞器及膜結(jié)構(gòu)被破壞的越嚴(yán)重。

2.4 溫度對赤霞珠葡萄果皮酚類物質(zhì)、香氣物質(zhì)含量的影響

檢測果皮殘留的酚類物質(zhì)（單寧、總酚、總花色苷）、香氣物質(zhì)含量，并進行顯著性分析確定不同溫度處理的顯著性差異。以16 ℃處理為對照組，酚類物質(zhì)、香氣物質(zhì)含量越低，表示從葡萄果皮中溶出的含量越高，結(jié)果如表1所示。

表 1 不同溫度處理后赤霞珠葡萄果皮中殘留酚類物質(zhì)和香氣物質(zhì)含量Table 1 Comparison of tannins, total phenolics, total anthocyanins and fl avor contents of Cabernet Sauvignon grape skins after cryogenic treatment at different temperatures

2.4.1 溫度對赤霞珠葡萄果皮酚類物質(zhì)含量的影響

隨處理溫度降低單寧含量呈下降趨勢，其中－32 ℃處理果皮單寧含量最低，液氮處理介于－20、－32 ℃之間；4、－8 ℃處理之間無顯著差異（P＞0.05），其他組處理之間差異顯著（P＜0.05）。隨處理溫度降低，總酚含量呈下降趨勢，液氮組總酚含量最低，－8、－20 ℃處理之間無顯著差異（P＞0.05），其他組處理之間差異顯著（P＜0.05）。總花色苷隨處理溫度降低呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，－32 ℃和液氮組處理的總花色苷含量最低且兩者之間無顯著差異（P＞0.05），其他組處理之間差異顯著（P＜0.05）。

2.4.2 溫度對赤霞珠葡萄果皮香氣物質(zhì)含量的影響

果皮殘留的香氣物質(zhì)含量越少，表明溶入葡萄酒中的香氣物質(zhì)含量越高。香氣物質(zhì)測定結(jié)果表明，－8、－20、－32 ℃處理的香氣物質(zhì)含量最低，3 個處理間無顯著差異，但大小關(guān)系為－32 ℃＜－8 ℃＜－20 ℃；液氮和16 ℃對照組之間無顯著差異（P＞0.05）；4 ℃香氣物質(zhì)含量最高。結(jié)果表明：－8、－20、－32 ℃處理能夠促進果皮的香氣物質(zhì)溶出，4 ℃處理阻礙了香氣物質(zhì)的溶出，液氮處理無顯著效果。

3 結(jié) 論

低溫處理會破壞葡萄果皮細胞的超微結(jié)構(gòu)，而且處理溫度越低，破壞作用越明顯。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明：16 ℃和4 ℃處理下細胞完整，細胞器清晰，細胞結(jié)構(gòu)沒有受到破壞；－8 ℃處理出現(xiàn)較明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象且分離強度隨溫度降低加?。唬?0 ℃處理出現(xiàn)細胞壁斷裂、細胞器和膜結(jié)構(gòu)破壞、細胞質(zhì)濃縮成團等現(xiàn)象，－32 ℃和液氮處理細胞破壞效果更明顯且伴隨細胞質(zhì)外泄、細胞器分解。－20 ℃處理雖能破壞膜系統(tǒng)，但細胞內(nèi)部仍有完整的細胞器，如葉綠體、線粒體；相比較而言，－32 ℃、液氮處理可以破壞所有的膜系統(tǒng)，但是葉綠體、線粒體內(nèi)部含有的葉綠素等物質(zhì)進入葡萄汁，能夠影響葡萄汁或酒的顏色、口感等特性，該影響是否有益還需進一步研究。4 組冷凍處理均能夠在細胞內(nèi)觀察到冰晶，證明了冰晶在破壞細胞時有作用效果。透射電子顯微鏡能清晰看到細胞內(nèi)外的物質(zhì)流動和細胞的活動痕跡，也間接證明了冷凍過程中存在低溫脅迫作用。

低溫處理能夠起到促進細胞釋放更多的單寧、淀粉等后含物。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明：－8、－20、－32 ℃和液氮處理都發(fā)現(xiàn)了單寧、淀粉粒等后含物。－8 ℃觀察到淀粉螺旋，但是其他低溫組沒有觀察到，可能是因為處理溫度過低，冷凍過程中出現(xiàn)類似馬鈴薯的“低溫糖化”[26]現(xiàn)象使淀粉螺旋斷裂分解。－8、－20 ℃處理能觀察到稀疏分散的體積較大的單寧、淀粉、糊粉粒等后含物，－32 ℃、液氮處理觀察到體積小、數(shù)量多且密集的后含物。4 種處理都觀察到較多的酶體，可能是一定溫度范圍內(nèi)的低溫脅迫使某些酶的活性增加[27]，從而使后含物暴露。

低溫處理不同程度上能夠促進葡萄果皮中單寧、總酚、總花色苷及香氣類物質(zhì)的溶出。－8、－20、－32 ℃能夠明顯促進酚類物質(zhì)和香氣物質(zhì)的溶出，這與電子顯微鏡觀察到的此溫度條件下暴露出較多的單寧等后含物結(jié)果一致。果皮溶出的香氣成分含量－32 ℃＞－8 ℃＞－20 ℃處理，這與已檢測到的低溫處理葡萄釀造的葡萄酒香氣物質(zhì)總量－20 ℃＞－8、－32 ℃處理略微不同，但是也能在一定程度上證明－8、－20 ℃處理葡萄可以顯著提高葡萄酒的香氣質(zhì)量[28]。4 ℃處理促進少量的酚類物質(zhì)溶出但對溶出香氣物質(zhì)無積極作用，此溫度條件下果皮細胞有較弱的呼吸作用且有輕微質(zhì)壁分離，果皮細胞酚類物質(zhì)減少可能與細胞與外界物質(zhì)交換有關(guān)，而香氣成分含量增加可能不僅與細胞的運輸方式有關(guān)，如借助膜蛋白運輸[29]，也與呼吸作用能夠產(chǎn)生部分芳香類化合物[30]有關(guān)。液氮處理能夠促進酚類物質(zhì)的溶出，電子顯微鏡也觀察到了細胞內(nèi)暴露的單寧等后含物，但其對香氣物質(zhì)溶出沒有明顯的效果。酚類物質(zhì)多存在于外表皮細胞中[31]，香氣物質(zhì)一般存在于果皮的下表皮細胞中，葡萄果粒經(jīng)液氮處理后迅速脫水皺縮呈不規(guī)則球狀，這種冷凍濃縮方式極大程度地保留了香氣成分[32]。

參考文獻：

[1] LUND S T, JOERG B. The molecular basis for wine grape quality: a volatile subject[J]. Science, 2006, 311: 804-805. DOI:10.1126/ science.1118962.

[2] PINELO M, ARNOUS A, MEYER A S. Upgrading of grape skins: significance of plant cell-wall structural components and extraction techniques for phenol release[J]. Trends in Food Science & Technology, 2006, 17(11): 579-590. DOI:10.1016/j.tifs.2006.05.003.

[3] POJER E, MATTIVI F, DAN J, et al. The case for anthocyanin consumption to promote human health: a review[J]. Comprehensive Reviews in Food Science & Food Safety, 2013, 12(5): 483-508. DOI:10.1111/1541-4337.12024.

[4] FALGINELLA L, GASPERO G D, CASTELLARIN S D. Expression of fl avonoid genes in the red grape berry of ‘Alicante Bouschet’ varies with the histological distribution of anthocyanins and their chemical composition.[J]. Planta, 2012, 236: 1037-1051. DOI:10. 1007/ s00425-012-1658-2.

[5] XU Y, SIMON J E, FERRUZZI M G, et al. Quantification of anthocyanidins in the grapes and grape juice products with acid assisted hydrolysis using LC/MS[J]. Journal of Functional Foods, 2012, 4(4): 710-717. DOI:10.1016/j.jff.2012.04.010.

[6] KENNEDY, JAMES A. Grape and wine phenolics: observations and recent fi ndings[J]. Ciencia E Investigación Agraria, 2008, 35(2): 107-120. DOI:10.4067/S0718-16202008000200001.

[7] HE Fei, LIANG Nana, MU Lin, et al. Anthocyanins and their variation in red wines I. monomeric anthocyanins and their color expression[J]. Molecules, 2012, 17(2): 1571-1601. DOI:10.3390/ molecules17021571.

[8] 李華. 葡萄酒中的丹寧[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2002, 30(3): 137-141. DOI:10.3321/j.issn:1671-9387.2002.03.034.

[9] MA Wen, GUO Anque, ZHANG Yulin, et al. A review on astringency and bitterness perception of tannins in wine[J]. Trends in Food Science & Technology, 2014, 40(1): 6-19. DOI:10.1016/j.tifs.2014.08.001.

[10] RINALDI A, ITURMENDI N, JOURDES M, et al. Transfer of tannin characteristics from grape skins or seeds to wine-like solutions and their impact on potential astringency[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 63(1): 667-676. DOI:10.1016/j.lwt.2015.02.037.

[11] MORRé D M, MORRé D J. Anticancer activity of grape and grape skin extracts alone and combined with green tea infusions.[J]. Cancer Letters, 2006, 238(2): 202-209. DOI:10.1016/j.canlet.2005.07.011.

[12] 李曉東, 何卿, 鄭先波, 等. 葡萄白藜蘆醇研究進展[J]. 園藝學(xué)報, 2011, 38(1): 171-184.

[13] 李記明. 葡萄酒品種香氣研究進展[C]//第四屆國際葡萄與葡萄酒學(xué)術(shù)研討會. 2005: 151-157.

[14] 張明霞, 吳玉文, 段長青. 葡萄與葡萄酒香氣物質(zhì)研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(7): 2098-2104. DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2008.07.030.

[15] FAN W, XU Y, JIANG W, et al. Identification and quantification of impact aroma compounds in 4 nonfloral Vitis vinifera varieties grapes[J]. Journal of Food Science, 2010, 75(1): 81-88. DOI:10.1111/ j.1750-3841.2009.01436.x

[16] CABRITA M J, FREITAS A M C, LAUREANO O, et al. Glycosidic aroma compounds of some Portuguese grape cultivars[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2006, 86(6): 922-931. DOI:10.1002/jsfa.2439.

[17] 范文來, 徐巖, 李記明, 等. 應(yīng)用HS-SPME技術(shù)分析葡萄果皮與果肉揮發(fā)性香氣物質(zhì)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2011, 37(12): 113-118. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2011.12.012.

[18] 吳凱, 周曉陽. 環(huán)境脅迫對植物超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 山東林業(yè)科技, 2007(3): 80-83. DOI:10.3969/j.issn.1002-2724.2007.03.034.

[19] 李建霞, 張出蘭, 夏曉飛, 等. 植物冰凍切片條件的優(yōu)化及其與石蠟切片在組織化學(xué)應(yīng)用中的比較[J]. 植物學(xué)報, 2013, 48(6): 643-650. DOI:10.3724/SP.J.1259.2013.00643.

[20] WINGER R J, FENERA O. Tenderness and water holding properties of?beef?muscle?inf l uencing?by?freezing?and?subsequent?storage?at?-3?or?15 ℃[J]. Journal of Food Science, 1976, 41: 1431-1438. DOI:10.1111/ j.1365-2621.1976.tb01189.x.

[21] TORRES C D, DíAZ-MAROTO M C, PéREZ-COELLO M S. Effect of freeze-drying and oven-drying on volatiles and phenolics composition of grape skin[J]. Analytica Chimica Acta, 2010, 660(1/2): 177-182. DOI:10.1016/j.aca.2009.10.005.

[22] TORRES C D, SCHUMACHER R, ALA?óN M E, et al. Freeze-dried grape skins by-products to enhance the quality of white wines from neutral grape varieties[J]. Food Research International, 2015, 69(1): 97-105. DOI:10.1016/j.foodres.2014.12.016.

[23] 彭傳濤, 賈春雨, 文彥, 等. 蘋果酸-乳酸發(fā)酵對于干紅葡萄酒感官質(zhì)量的影響[J]. 中國食品學(xué)報, 2014, 14(2): 261-268.

[24] 張紅娟, 楊繼紅, 唐福旭, 等. 陜西涇陽赤霞珠葡萄冷凍處理釀酒特性研究[J]. 中國釀造, 2014, 33(6): 58-62. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2014.06.014.

[25] 馬丹丹, 鄧雨青, 周彥, 等. 電鏡技術(shù)在植物病害研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報, 2016, 32(3): 38-43. DOI:10.13560/j.cnki.biotech. bull.1985.2016.03.007.

[26] 石偉平. 二倍體馬鈴薯遺傳群體的構(gòu)建和抗低溫糖化分析[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010: 10-12. DOI:10.7666/d.y1799610.

[27] 周斌, 張金龍, 馮紀(jì)年, 等. 短期低溫脅迫對核桃抗氧化酶活性的影響[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報, 2015, 30(3): 51-53. DOI:10.3969/ j.issn.1001-7461.2015.03.09.

[28] 李娜娜, 王華, 唐國冬, 等. 低溫處理葡萄對愛格麗干白葡萄酒香氣成分的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(13): 71-76. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613013.

[29] 郭子濤. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在Caco-2細胞中的攝取、跨膜轉(zhuǎn)運和外排研究[D]. 上海: 華東師范大學(xué), 2011: 17-18.

[30] 周然. 黃花梨運輸振動損傷與冷藏品質(zhì)變化的試驗研究[D]. 上海:上海交通大學(xué), 2007: 35.

[31] LUND S T, BOHLMANN J. The molecular basis for wine grape quality-a volatile subject[J]. Science, 2006, 311: 804-805. DOI:10.1126/science.1118962.

[32] 孫卉卉, 馬會勤, 陳尚武. 冰凍濃縮對低糖葡萄汁及葡萄酒品質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(5): 86-89. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.05.017.

Effect of Cryogenic Treatment on the Structure of Grape Skin Cells

TANG Guodong1, TIAN Yu2, WANG Qian2, YANG Jihong1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Grape and Wine Test Station, Northwest A&F University, Heyang 715300, China)

Objective: The effect of cryogenic treatment on the structure of grape skin cells was investigated to reveal the mechanism of wine quality improvement. Methods: Grapes of the cultivars Hutai No. 8 and Cabernet Sauvignon were treated at?4,??8,??20?and??32?℃ and with liquid nitrogen, respectively, and then examined with an electron microscope. The contents of tannins, total phenols, total anthocyanins and aroma compounds were also determined. Results: Grape skin cells had no signif i cant?change?after?treatment?at?4?℃, but cell plasmolysis and crystals of tannin and starch were observed after treatment at??8?℃. Serious deformation of cells, clutter of intracellular contents, cracking of the cell membrane and organelles, and exosmosis of cell inclusion were observed in parallel with the increase of ergastic substances and crystals after treatment at?20?℃.?The?structures?of?the?cell?wall?and?membrane?were?destroyed?completely?after?treatments?at??32?℃ and with liquid nitrogen.?These?data?showed?that?cryogenic?treatment?especially?at??8,??20?and??32?℃ allowed the extraction of more tannins, total phenols, total anthocyanins and aroma compounds from grape skins, and the contents of these substances were signif i cantly?different?at?different?treatment?temperatures.?However,?aroma?substances?could?not?be?extracted?at?4?℃ and liquid nitrogen. Conclusion: Cryogenic treatment results in cell damage of grape skins and improved exosmosis of phenolics and?aromatic?compounds,?thereby?being?benef i cial?to?wine?quality.

grape; cryogenic treatment; grape skin cells; electron microscope; wine quality

10.7506/spkx1002-6630-201705031

TS261.2

A

1002-6630（2017）05-0191-06

唐國冬, 田雨, 王倩, 等. 低溫處理對葡萄果皮細胞結(jié)構(gòu)的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 191-196. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705031. http://www.spkx.net.cn

TANG Guodong, TIAN Yu, WANG Qian, et al. Effect of cryogenic treatment on the structure of grape skin cells[J]. Food Science, 2017, 38(5): 191-196. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705031. http://www.spkx.net.cn

2016-04-06

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項目（2015NY019）；西北農(nóng)林科技大學(xué)科研專項資金項目（Z109021563）

唐國冬（1989—），男，碩士研究生，主要從事葡萄與葡萄酒工程研究。E-mail：1074743761@qq.com

*通信作者：楊繼紅（1975—），女，副教授，博士，主要從事葡萄工程學(xué)研究。E-mail：yangjihong@nwsuaf.edu.cn