張 青，余以剛，王 成，尹壽偉，劉湘川，周海鵬

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640； 2.廣東漢肽生物工程有限公司，廣東 廣州 510640)

蠅蛆營(yíng)養(yǎng)成分分析及其蛋白提取工藝的研究

張 青1，余以剛1，王 成1，尹壽偉1，劉湘川2，周海鵬2

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640； 2.廣東漢肽生物工程有限公司，廣東 廣州 510640)

研究以蠅蛆為原料，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)成分及氨基酸組成分析，綜合評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。同時(shí)采用稀堿法提取蠅蛆蛋白，以提取率為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化法考察NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比以及提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響。結(jié)果表明:蠅蛆蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.73%，必需氨基酸與氨基酸總量比值(E/T)為41.012%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(E/N)為69%，均優(yōu)于FAO/WHO提出的參考蛋白及氨基酸模式。稀堿法提取蛋白最佳工藝為:NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、料液比1∶15 g/ml、提取溫度60℃。在此最佳工藝條件下蠅蛆蛋白的實(shí)際提取率可達(dá)58.21%;其中各因素影響程度大小依次為:溫度、氫氧化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比。

蠅蛆；營(yíng)養(yǎng)成分；氨基酸評(píng)分；蛋白提取；響應(yīng)面優(yōu)化

昆蟲(chóng)作為地球上最大的生物群類(lèi)，不僅蛋白質(zhì)含量高，而且氨基酸組成比較合理[1]。昆蟲(chóng)蛋白中有豐富的賴(lài)氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸，但色氨酸較低。常規(guī)動(dòng)植物食品中普遍缺乏賴(lài)氨酸、蛋氨酸，但色氨酸含量卻很高[2-3]。在日常飲食中，賴(lài)氨酸和蛋氨酸含量偏低[4]。因此，將昆蟲(chóng)蛋白粉加入到常規(guī)食品中混合食用可以相互補(bǔ)充，對(duì)于人體合理和全面攝取營(yíng)養(yǎng)及保障健康具有重要的意義[5]。到目前為止，已用蜂王、螞蟻、蜜蜂幼蟲(chóng)等開(kāi)發(fā)出多種產(chǎn)品。其中，有螞蟻制備的口服液和沖劑等功能性產(chǎn)品[6-7]，利用蠶蛹制成的復(fù)合氨基酸粉、蛋白粉和運(yùn)動(dòng)飲料[8]。

家蠅，屬雙翅目，蠅科，是昆蟲(chóng)家族中的一大類(lèi)，種類(lèi)多、數(shù)量大，是一種非常重要的蛋白資源[9-10]。其幼蟲(chóng)即為蠅蛆，是目前蠅蛆蛋白研究的主要材料。因此，利用蠅蛆蛋白進(jìn)行深加工，開(kāi)發(fā)蛋白粉及氨基酸產(chǎn)品等，提高產(chǎn)品的附加值，是非常必要且有實(shí)際意義的工作。目前，工業(yè)化生產(chǎn)提取昆蟲(chóng)蛋白的的主要方法有堿法和酶法[11-13]，酶法雖然可保持蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能，但是提取成本高。堿法效率高，能耗和成本較低，但蛋白會(huì)有損失。本研究以蠅蛆為原料，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析和氨基酸組成分析，綜合評(píng)價(jià)蠅蛆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并采用稀堿法提取蠅蛆蛋白，響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，為蠅蛆蛋白的深加工和功能性食品的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠅蛆(fly larvae)由中山大學(xué)提供；氨基酸標(biāo)品購(gòu)于Sigma公司；氫氧化鈉(NaOH)、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、鹽酸、濃硫酸、硼酸，均為分析純。

KDN-F自動(dòng)凱氏定氮儀，上海纖維儀器有限公司；電熱恒溫(鼓風(fēng))干燥箱，上海上邁電子儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，上海廣英儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠；日立835-50氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.2 方法與步驟

1.2.1 原料預(yù)處理

將蠅蛆用高速粉碎機(jī)粉碎，采用正己烷(固液比1∶10)浸泡48 h脫脂，減壓蒸餾回收正己烷。將脫脂的蠅蛆粉50～60℃條件下熱風(fēng)干燥去除殘留的溶劑，常溫保存。

1.2.2 蠅蛆營(yíng)養(yǎng)成分分析

水分測(cè)定：參照GB 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》，105℃烘箱干燥法；脂肪測(cè)定：采用索氏提取法，參照GB/T 5512-2008《食品中脂肪的測(cè)定》；蛋白質(zhì)的測(cè)定：利用自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定；灰分的測(cè)定：采用灼燒法，參照GB 5009.4-2010《食品中灰分的測(cè)定》。

甲殼素類(lèi)化合物的測(cè)定[14]：將脫脂的蠅蛆粉，浸入2%NaOH溶液中，低速攪拌，室溫反應(yīng)4 h，利用紗布過(guò)濾，再浸入10%NaOH溶液中，85℃反應(yīng)4 h，紗布過(guò)濾后，水洗至中性，加入2 mol/L鹽酸按5∶1 反應(yīng)1 h，抽濾，水洗至中性。濾渣再經(jīng)6%H2O2脫色，得到甲殼素類(lèi)化合物。

1.2.3 氨基酸組成分析及評(píng)價(jià)

1.2.3.1 氨基酸分析

稱(chēng)取約150 mg蠅蛆粉末至水解管，按1∶1加入6 mol/L鹽酸5 ml，酒精噴燈后，于110℃水解24 h。水解后冷卻至室溫，過(guò)濾，用超純水定容至25 ml量取1 ml樣品，置烘箱脫酸，脫至干燥后加入3 ml稀釋液混合均勻，并用針管吸取1 ml，經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后裝入試劑瓶中，備用[15]。

1.2.3.2 氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

蠅蛆的氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)價(jià)采用FAO/WHO建議的每克氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式，參考文獻(xiàn)方法[16-17]對(duì)氨基酸評(píng)分(ASS)、化學(xué)評(píng)分(CS)進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式如下：

1.2.4 蠅蛆蛋白的提取和測(cè)定

參照Z(yǔ)hang等[18]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，取2 g脫脂蠅蛆粉末，按料液比加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氫氧化鈉溶液，混勻，在一定溫度下浸提1 h，期間每隔15 min攪拌一次。取出浸提液于4 000 r/min條件下離心10 min，取上清，棄沉淀，并用去離子水定容至100 ml。取一定量的提取液，利用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定提取液中蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算提取率：

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)定

NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/ml)，浸提溫度50、60、70、80、90℃?？疾靻我蛩貢r(shí)，其它條件固定為：NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，料液比1∶15，浸提溫度60℃。

1.2.6 蠅蛆蛋白質(zhì)提取的響應(yīng)面設(shè)計(jì)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定因素NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度中心水平值分別為2%、1∶15 g/ml、70℃，并采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X1)、料液比(X2)、提取溫度(X3)做三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并以蛋白質(zhì)提取率Y為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共有17個(gè)實(shí)驗(yàn)，分別為12個(gè)析因試驗(yàn)、5個(gè)中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平編碼見(jiàn)下表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼

2 結(jié)果與討論

2.1 蠅蛆主要組成成分

蠅蛆的主要組成成分見(jiàn)表2，可以發(fā)現(xiàn)蠅蛆的蛋白質(zhì)和脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)很高，分別51.73%和17.92%，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表2 蠅蛆組成成分分析

2.2 蠅蛆蛋白氨基酸組成及必需氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

一般蛋白質(zhì)中所含必需氨基酸的種類(lèi)、含量及組成比例決定蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低。蠅蛆蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析及必須氨基酸組成見(jiàn)表3。

從表3可知道，蠅蛆各類(lèi)氨基酸的種類(lèi)齊全，共檢測(cè)到17種，并且人體所需的9種必需氨基酸都存在，其中，色氨酸在樣品處理后未檢測(cè)出。蠅蛆的必需氨基酸占氨基酸總量的40.81%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為0.69，均略高于參考模式的40%和0.6。

蠅蛆蛋白模式及必需氨基酸評(píng)價(jià)分析見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，以FAO/WHO 評(píng)分模式和雞蛋蛋白的必需氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算蠅蛆的AAS及CS值，可以發(fā)現(xiàn)除了異亮氨酸的氨基酸評(píng)分(AAS)略低于FAO/WHO，其余的都高于FAO/WHO的氨基酸評(píng)分(AAS)?？傊?，蠅蛆蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。

表3 蠅蛆蛋白質(zhì)氨基酸組成

注：原料經(jīng)脫脂脫水處理后，進(jìn)行氨基酸分析；色氨酸未測(cè)出；E為必需氨基酸總和；N為非必需氨基酸總和。

表4 蠅蛆蛋白模式及必需氨基酸評(píng)價(jià)分析

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

通過(guò)文獻(xiàn)[19-21]以及預(yù)實(shí)驗(yàn)得出，影響稀堿法提取蛋白的主要因素有NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比和浸提溫度，故選取這3個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蠅蛆蛋白提取率的影響

由圖1可知，蠅蛆蛋白的提取率隨著NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.0%時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大，這可能是因?yàn)榈唾|(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH不能有效的將蛋白質(zhì)溶出，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaOH會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而影響蛋白質(zhì)的提取率。

圖2 料液比對(duì)蠅蛆蛋白提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶15 g/ml時(shí)，蛋白質(zhì)的溶出量最佳。由圖3可知，溫度50～70℃時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率緩慢上升，并在70℃時(shí)達(dá)到最大，70～90℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率急劇下降，這可能是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間構(gòu)想發(fā)生變化而致其變性沉降，蛋白質(zhì)的提取率降低。因此，選取NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、料液比1∶15、浸提溫度70℃作為響應(yīng)面中心點(diǎn)。

圖3 溫度對(duì)蠅蛆蛋白提取率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果分析

2.4.1 模型建立及顯著性分析

以NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X1)、料液比(X2)、提取溫度(X3)為響應(yīng)變量，以蠅蛆蛋白質(zhì)提取率(Y)為響應(yīng)值，響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見(jiàn)表5，模型回歸方程方差分析見(jiàn)表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 模型回歸方程方差分析

利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到回歸模型方程如下：

Y=57.88-1.38X1-1.26X2-1.71X3+

0.83X1X2+0.27X1X3+0.37X2X3-

由表6可以看出，模型的P=0.000 2<0.01，模型達(dá)到極顯著。模型誤差失擬P=0.641 9>0.05，該模型失擬不顯著，說(shuō)明該響應(yīng)面分析方程對(duì)試驗(yàn)擬合度較好，可靠性較高。應(yīng)用該回歸模型能夠?qū)ο壡鞍踪|(zhì)提取效果進(jìn)行較好地分析和預(yù)測(cè)。

2.4.2 蠅蛆蛋白提取響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面圖，如圖4～圖6。

圖4 蛋白質(zhì)提取率與NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度的響應(yīng)面圖

由圖4可知，隨著因素NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增大，響應(yīng)值先增大后減小趨勢(shì)，存在極大值。在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同情況下，隨著提取溫度不斷增大，響應(yīng)面值小幅度下降。

圖5 蛋白質(zhì)提取率與NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比的響應(yīng)面圖

圖6 蛋白質(zhì)提取率與提取溫度、料液比的響應(yīng)面圖

由圖5可知，隨著NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比的數(shù)值不斷增大，響應(yīng)面的值都是先增大后減小，在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比的中心點(diǎn)附近蛋白質(zhì)提取率有最大值，此時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最大。綜上所述，當(dāng)溫度確定為某一值不變時(shí)，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比都在中心點(diǎn)附近時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率比較高，有利于蛋白的提取，回歸方程有最優(yōu)水平。

2.4.3 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證

將回歸方程對(duì)X1、X2、X3分別取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，進(jìn)行解方程，得到最優(yōu)提取條件為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.91%、溫度60℃、料液比1∶14.48，理論提取率58.98%。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、溫度60℃、料液比1∶15，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，得到的蛋白質(zhì)的提取率為(58.21±0.10)%，模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)實(shí)際值相對(duì)偏差較小，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選模型具有很高的擬合性。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)測(cè)定蠅蛆蛋白氨基酸組成成分，參考FAO/WHO的蛋白理想模式對(duì)蠅蛆氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)，蠅蛆蛋白質(zhì)的必需氨基酸占總氨基酸40.81%，必需氨基酸占與非必需氨基酸的比值為0.69，都優(yōu)于FAO/WHO蛋白理想模式的40%和0.60。

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析了稀堿法提取蠅蛆蛋白的最優(yōu)條件，并在此基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到最佳提取工藝：NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%；提取溫度60℃；料液比1∶15 g/ml。在此條件下，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到(58.21±0.10)%，建立的回歸模型能很好地預(yù)測(cè)蠅蛆蛋白提取率。

[1] YI L,LAKEMOND C M M,SAGIS L M C,et al.Extraction and characterisation of protein fractions from five insect species[J].Food Chemistry,2013,141(4):3 341-3 348.

[2] Finke M D.Nutrient Content of Insects [M].Netherlands：Capinera Springer,2008.

[3] 趙國(guó)玉,曹 莉,陳鏡華,等.昆蟲(chóng)蛋白的價(jià)值、應(yīng)用及提取工藝[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2015,37(4):894-904.

[4] 王小生.必需氨基酸對(duì)人體健康的影響[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2005(7):48-49.

[5] 李文賓,吳敏麗,廉振民,等.中國(guó)昆蟲(chóng)資源研究開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀[J].氨基酸和生物資源,2008,30(4):21-25.

[6] 劉培勇.螞蟻混懸型口服液的生產(chǎn)工藝及其主要營(yíng)養(yǎng)成分的研究[J].中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志,2008.

[7] 朱海波.復(fù)方蜂王胎口含片的研制及其抗疲勞功能的實(shí)驗(yàn)研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué),2007.

[8] 陳 靜,鄭明珠,王 浩.蠶蛹蛋白肽的制備及其運(yùn)動(dòng)飲料研制[J].食品科學(xué),2009,30(14):318-320.

[9] 魏 震,周定剛,任永林,等.蠅蛆粉作為魚(yú)粉替代物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].糧食與飼料工業(yè),2008(9):34-35.

[10] OGUNJI J O,KLOAS W,WIRTH M,et al.Housefly Maggot Meal (Magmeal) as a Protein Source for Oreochromisniloticus (Linn.)[J].Asian Fisheries Science，2008,21:319-331.

[11] 潘怡歐.昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)提取工藝的比較研究[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[12] STEINER H,HULTMARK D,ENGSTRAM A,et al.Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J].Journal of Immunology,2009,182(11):6 635-6 637.

[13] 孫 雁,任發(fā)政,范金波,等.堿法制備蠶蛹蛋白浸提條件的優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2009,25(2):285-289.

[14] 馬翠翠,任 健.蠅蛆殼制備殼聚糖的工藝條件研究[J].現(xiàn)代食品科技,2013(2):331-334.

[15] 郝莉花,陳復(fù)生,劉昆侖,等.不同品種花生油脂體粒徑電位和蛋白質(zhì)組成的分析[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2016,32(18):279-284.

[16] 宋偉雅,曹培讓,蔣 將,等.食用五谷蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)以及油脂提取工藝的研究[J].食品工業(yè),2015(10):15-19.

[17] IBIRONKE S,FASHAKIN J B,BADMUS A O.Nutritional evaluation of complementary food developed from plant and animal protein sources[J].Nutrition & Food Science,2012,42(2):111-120.

[18] ZHANG A J,WU Y J,CHEN C,et al.Extraction of edible protein from the housefly larvae[J].Chinese Bulletin of Entomology,2009:627-631

[19] 李 帥,張愛(ài)忠,李玲玲,等.蠅蛆蛋白的提取及相對(duì)分子量的鑒定[J].特產(chǎn)研究,2008,30(1):15-18.

[20] 黃偉光.蠅蛆蛋白的提取及其抗菌活性研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué),2011.

[21] HOU L,SHI Y,ZHAI P,et al.Antibacterial activity and in vitro anti-tumor activity of the extract of the larvae of the housefly (Muscadomestica)[J].Journal of Ethnopharmacology,2007,111(2):227-231.

(責(zé)任編輯：梅 竹)

Nutrition components analysis of fly larvae and its protein extraction process

ZHANG Qing1,YU Yi-gang1,WANG Cheng1,YIN Shou-wei1，LIU Xiang-chuan2，ZHOU Hai-peng2

(1.College of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Guangdong Hantai Bio-engineering Co.Ltd.,Guangzhou 510640,China)

For the nutritional evaluation of fly larvae,comprehensive evaluation of the nutritional value of fly larvae was assessed through the nutritional content and amino acid composition analysis.By dilute alkali extraction method,with the extraction rate as index,using single factor experiment and the response surface optimization method,the effects of NaOH concentration,solid-liquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of protein was studied.The results showed that the protein content of fly larvae was 51.73%,among which the ratio of E/T (essential amino acid/ total amino acid) was 41.01% and E/N (essential amino acid/non-essential amino acid) was 69%,both much better than the protein standard suggested by FAO/WHO.The protein extraction yield under the optimization condition was 58.21% and the optimized protein extraction process using alkaline solution were as follows: 2% of sodium hydroxide,1∶15 of solid-liquid ratio and reaction temperature of 60℃.Among which,the parameters which affected the protein yield in descend order were temperature,the concentration of sodium hydroxide and solid-liquid ratio.

fly larvae;nutritional content;amino acid score;protein extraction;response surface methodology

2016-01-03；

2017-02-15

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016B090918103)。

張 青(1993-)，男，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

余以剛(1968-)，男，教授，，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.03.009

S816.9

A

1003-6202(2017)03-0033-05