曾嘉毅 劉志華 陳菲 蘇士成*

乳腺癌組織中RBM24的表達(dá)及其預(yù)后分析

曾嘉毅1#劉志華2#陳菲3蘇士成3*

目的探討乳腺癌組織中RNA結(jié)合蛋白24（RNA-binding protein 24，RBM24）的表達(dá)及其預(yù)后分析。方法收集中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院手術(shù)切除并由病理確診的乳腺癌及癌旁正常組織標(biāo)本各24例，通過(guò)RT-PCR和Western blotting檢測(cè)RBM24的表達(dá)，同時(shí)結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，判斷RBM24的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果乳腺癌組織中的RBM 24mRNA和蛋白水平明顯低于癌旁組織（P＜0.001）。同時(shí)K-M法分析顯示RBM24陽(yáng)性的乳腺癌患者5年生存期（OS）高于陰性患者（P＜0.05）。結(jié)論RBM24在乳腺癌中低表達(dá)，并且與乳腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，因此可作為判斷乳腺癌預(yù)后的一個(gè)重要參考指標(biāo)。

乳腺組織；RNA結(jié)合蛋白24；預(yù)后

近年來(lái)乳腺癌發(fā)病率明顯增加，是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是女性最常見(jiàn)的致死原因之一［1］。雖然治療乳腺癌患者的水平得到了大幅度提高，但國(guó)內(nèi)乳腺癌的死亡率仍呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，增幅高達(dá)67.8%［2］。乳腺癌的治療與預(yù)防在于乳腺癌的早期診斷，然而由于其發(fā)病隱匿，早期臨床癥狀不是很明顯，容易被患者及醫(yī)生忽視。因此，尋找能早期診斷，治療及預(yù)防的分子標(biāo)記物是進(jìn)一步改善乳腺癌患者預(yù)后的重要目標(biāo)。

RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding protein）在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起著重要的作用，它通過(guò)和RNA相互作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。該類(lèi)蛋白參與RNA剪接、多聚胸苷化作用、序列編碼、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、維持RNA的穩(wěn)定和降解、細(xì)胞內(nèi)定位和翻譯調(diào)控等。RBM24是一種具有與RNA結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白，該蛋白在心臟和骨骼肌肉組織中有明顯的表達(dá)，同時(shí)在肌原性的分化和心臟發(fā)育中起著重要的作用。最近的研究也表明，在人類(lèi)癌癥細(xì)胞系中，它可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)p21和p63的穩(wěn)定性［3］，同時(shí)在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)RBM24通過(guò)上調(diào)miR-25來(lái)抑制腫瘤的進(jìn)展［4］。目前RBM24在乳腺癌的研究尚未報(bào)道，本研究通過(guò)RT-PCR和Western-blotting聯(lián)合檢測(cè)RBM24在mRNA及蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，探討RBM24在人類(lèi)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中所起的作用及臨床意義，為進(jìn)一步探討乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象收集2009年2月至2013年7月間，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院乳腺中心的手術(shù)切除乳腺癌組織及距離癌灶5 cm以上癌旁正常組織共24對(duì)，年齡33～45歲。經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為乳腺癌，新鮮標(biāo)本放入液氮后存放于-80℃保存。所有病例均征得患者同意并簽署相關(guān)同意書(shū)。

1.1.2 數(shù)據(jù)資料收集利用Bioconductor/TCGAbiolinks函數(shù)包從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//gdc-portal. nci.nih.gov/）下載并預(yù)處理乳腺癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)RNASEqV2數(shù)據(jù)。

1.1.3 主要試劑主要試劑：兔抗人RBM24多克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)），總RNA提取試劑盒Trizol（sigma公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司，美國(guó)），RBM24基因和內(nèi)參β-actin基因的特異性引物由廣州市睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，其中RBM24上游為CCAAGGATCATGCAACCAG，下游為GCAGGTATCCCGAAAGGTCT，β-actin上游為AGCCTCGCCTTTGCCGATCC，下游為ACATGC CGGAGCCGTTGTCG。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取用液氮研磨法將24對(duì)新鮮乳腺癌組織磨成粉末，加入Trizol，按照Trizol裂解抽提組織中總RNA，一般100～200mg組織加入1mL Trizol。，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度，同時(shí)計(jì)算A260/A280值檢測(cè)RNA純度。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)組織中RBM24的mRNA的表達(dá)在測(cè)定RNA濃度后，取等量RNA模板加樣，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增為cDNA。然后采用SYBR greenⅠ染料，在ROCHE 480 Real-time PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以βactin為內(nèi)參照，采用行對(duì)定量法計(jì)算。

1.2.3 乳腺癌及癌旁組織中RBM 24蛋白的表達(dá)按照總蛋白試劑盒（p1250，總蛋白提取試劑盒，普利萊基因技術(shù)有限公司）提供的程序從21對(duì)新鮮冷凍組織中提取總蛋白。通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，取等量蛋白加入上樣緩沖液并煮沸變性，采用15%SDS-PAGE分離膠，5%SDS-PAGE濃縮膠。取30μg蛋白樣品加入上樣孔，先以70 V恒壓電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至100 V，至目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1 cm以上停止電泳。再用200mA恒流，2 h轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜浸入封閉液中1 h，加入1∶1000 RBM24抗體放置在搖床上4℃過(guò)夜。次日回收一抗，洗膜3次，后加入1∶3000二抗，室溫孵育45min，洗膜3次用Bio-Rad成像系統(tǒng)顯影。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Paired t test檢驗(yàn)RBM24在乳腺癌和癌旁組織中mRNA的表達(dá)水平。關(guān)于預(yù)后的判斷采用Kaplan-Meier生存分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α取0.05，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 RBM24基因在癌組織和癌旁中mRNA的表達(dá)

使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)24對(duì)乳腺癌患者組織中檢測(cè)RBM24的含量，結(jié)果提示RBM24mRNA

在乳腺癌組中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001，圖1）。

圖1 RBM 24在乳腺癌組織中和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量***P＜0.001

2.2 RBM24蛋白Western blotting檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)Western blotting檢測(cè)了21對(duì)乳腺癌及其癌旁組織中RBM24的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與癌旁組織性比，乳腺癌組織中RBM24的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中11對(duì)乳腺癌及其癌旁組織中RBM 24的Western Blotting如圖所示（圖2）。

圖2 RBM 24蛋白在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

圖3 RBM 24m RNA高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線（Kap lan-M eier法）

2.3 RBM24相對(duì)表達(dá)量與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

從Bioconductor/TCGAbiolinks函數(shù)包從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//gdc-portal.nci.nih.gov/）下載并利用R語(yǔ)言（Deseq和edgeR程序包）對(duì)853例浸潤(rùn)性乳腺癌（隨訪時(shí)間為5年）預(yù)處理，對(duì)樣本的RBM24的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了ROC曲線的分析，將數(shù)據(jù)分為兩等分，以RBM24的表達(dá)水平的中位數(shù)145.3為界，低于中位數(shù)節(jié)點(diǎn)的樣本為低表達(dá)組，而高于該中位數(shù)的為高表達(dá)組。Kaplan-Meier生存分析提示：RBM24表達(dá)與患者的5年生存時(shí)間（OS）呈明顯負(fù)相關(guān)，即RBM25高表達(dá)患者的5年生存時(shí)間明顯高于RBM24低表達(dá)者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0018，圖3）。

3 討論

RNA結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，通?？s寫(xiě)為RBPS）是一種在細(xì)胞內(nèi)與雙或單鏈RNA結(jié)合并且參與形成核糖核蛋白復(fù)合物的蛋白。該類(lèi)蛋白包含各種結(jié)構(gòu)域，如RNA識(shí)別序列（RNA recognition motif，RRM），雙鏈RNA結(jié)合域，鋅指結(jié)構(gòu)等等［5］。目前有研究表明RNA結(jié)合蛋白在線蟲(chóng)的早期胚胎發(fā)育中起著重要的作用［6］，此外，RBPS的出現(xiàn)在腫瘤發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［7］。在不同的癌癥中，檢測(cè)到了許多RBPS的異常表達(dá)，如乳腺癌CELF3，肝癌RBM24，和肺癌IGF2BP2/3等等，盡管RBPS在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的起著如此重要的作用，但很少有對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的研究。

RBM24是一種RNA結(jié)合蛋白，目前對(duì)該基因的研究很少。近年來(lái)的研究表明在人和小鼠的胚胎干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的過(guò)程中，RBM24上調(diào)［8］。同時(shí)也有研究證實(shí)，RBM24的同源體最先在斑馬魚(yú)、青蛙、小鼠胚胎的心臟前體中表達(dá)，然后再分化的心肌中表達(dá)。在敲低RBM24后將會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎肌節(jié)蛋白的減少，肌原纖維的降解，進(jìn)而導(dǎo)致心率改變和血流量的減少［9］。最近的研究發(fā)現(xiàn)RBM24能結(jié)合到p63的3′UTR，導(dǎo)致p63轉(zhuǎn)錄子發(fā)生降解，該蛋白中的RNA結(jié)合區(qū)域是RBM24與p63結(jié)合所必須的，并能抑制p63的表達(dá)［10］。同時(shí)也有研究表明，RBM24通過(guò)與p21的3′UTR區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，從而增加p21的表達(dá)［11］。P53結(jié)合到RBM24基因的啟動(dòng)子上，通過(guò)啟動(dòng)子上的p53應(yīng)答原件轉(zhuǎn)錄調(diào)控RBM24。同時(shí)RBM24通過(guò)與p21的3′UTR區(qū)的ARE結(jié)合，進(jìn)而維持了p21的轉(zhuǎn)錄活性。目前在腫瘤中對(duì)該基因的研究知之甚少，因此本研究收集手術(shù)切除乳腺癌及癌旁正常組織，進(jìn)行Western blot和RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果提示RBM24mRNA和蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)通過(guò)結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床數(shù)據(jù)分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RBM24與乳腺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，因此可以認(rèn)為RBM 24在判斷乳腺癌的臨床預(yù)后中具有一定的指導(dǎo)意義，這也提示RBM24表達(dá)可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是對(duì)于該基因的分子機(jī)制有待進(jìn)一部的研究。

本研究的不足之處在于，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提供的是mRNA水平的數(shù)據(jù)，有可能無(wú)法完全代表RBM24的蛋白水平表達(dá)情況，在后續(xù)的研究中要結(jié)合免疫組化的方法進(jìn)一步研究該基因與臨床病理的生物學(xué)行為的關(guān)系。同時(shí)本研究為后續(xù)關(guān)于RBM24在其他腫瘤中的基礎(chǔ)研究和臨床研究提供了線索和依據(jù)，需要進(jìn)一步的研究和探討RBM 24的作用機(jī)理，為腫瘤的治療提供新思路。

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Expression of RNA-binding p rotein 24 and its association with prognosis in breast cancer

ZENG Jiayi1*，LIUZhihua2*，F(xiàn)EIChen3，SU Shicheng3.
1GuangzhouZhi-xin High School；2Sun Yat-sen University Cancer Center；3Sun Yat-sen Memorial Hospital，University，Guangzhou 510120，China.Correspondine author:SU Shicheng，seasonso@163.com

ObjectiveTo explore the expression of RNA-binding protein 24 and its prognostic significance in breast cancer.MethodsTwenty-four pairs of breast cancer tissues and paraneoplastic breast tissueswere collected.ThemRNA and protein of RBM24 in these tissue sampleswere detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）and western blotting.Meanwhile，we examined the clinical significance of RBM24 in breast carcinoma using TCGA data.ResultsThemRNA and protein of RBM24 was significantly higher in the paraneoplastic breast tissues than in the breast cancer tissues（P＜0.001）.Kaplan-Meier univariate survival analysis suggested that high RBM 24 expression was associated with poor overall survival（P＜0.05）.ConclusionRBM24 was downregulated in breast cancer，which was associated with poor prognosis.Therefore，RBM24may serve as a prognostic biomarker for breast cancer.

breastcancer；RNA-binding protein 24；prognosis

R737.9

10.3969/j.issn.1009-976X.2017.01.007

2016-12-23）

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81372816）

1510080廣州廣州市執(zhí)信中學(xué)；2510060廣州中山大學(xué)腫瘤防治中心；3510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院乳腺癌醫(yī)學(xué)部

#同等貢獻(xiàn)

*通訊作者：蘇士成；Email：seasonso@163.com