王碩,李永盛,邊睿,戴一星,郎美東,劉穎斌,施偉斌
(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 普通外科,上海 200092;2. 上海市膽道疾病研究所,上海 200092;3. 華東理工大學(xué)材料學(xué)院,上海 200237)
胃癌是世界上常見(jiàn)惡性腫瘤,致死率位于所有惡性腫瘤中的第三位[1]。晚期胃癌預(yù)后往往較差,平均生存時(shí)間約為半年[2]。阿帕替尼(apatinib)可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路抑制腫瘤內(nèi)新生血管生成,達(dá)到抗胃癌效果[3]。2014年,apatinib作為晚期胃腺癌或胃-食管結(jié)合部腺癌患者三線及三線以上治療方案獲得中國(guó)食品藥品監(jiān)管局批準(zhǔn)上市[4]。apatinib明顯改善了晚期胃癌患者的生存期,但也存在著一些副作用[4-6]。雖然apatinib的副作用可通過(guò)減藥或者停藥來(lái)改善,但這降低了apatinib的抗腫瘤效果。近期的一項(xiàng)研究[7]表明,間斷使用抗VEGF治療可能誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移。因此,有必要尋找一種能降低apatinib的副作用促使apatinib能夠長(zhǎng)期不間斷應(yīng)用的方法,使apatinib更好的發(fā)揮抗腫瘤作用。
目前,納米載藥技術(shù)是實(shí)現(xiàn)藥物緩釋作用、改善藥物副作用、增加藥物反應(yīng)時(shí)間的有效手段[8-10]。本實(shí)驗(yàn)擬合成一種載apatinib納米膠束,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及安全性實(shí)驗(yàn),以評(píng)價(jià)納米載apatinib對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的抑制作用。
HUVECs、內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BM)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGS)、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、雙抗(P/S)、牛纖維蛋白均購(gòu)自于美國(guó)Sciencell公司;重組人內(nèi)皮細(xì)胞血管生長(zhǎng)因子(rhVEGF121)購(gòu)自南京Genscript公司;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購(gòu)自于Hyclone公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;CCK-8購(gòu)自于日本同仁公司;基底膠(Matrigel)購(gòu)自于美國(guó)BD公司;T-25培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、Transwell小室購(gòu)自于Corning公司;apatinib由江蘇恒瑞公司提供;單甲醚聚乙二醇嵌段聚己內(nèi)酯載apatinib納米膠束(MPEG5000-b-PCL5000-apatinib)由合作單位華東理工大學(xué)材料學(xué)院合成,其最佳載藥率為16.21%,對(duì)應(yīng)的包封率為56.74%,平均粒徑(55.7±4.1)nm,呈球形、近單分散體系;MCO15AC型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司);臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo science);Olympus顯微鏡BX-53(日本Olympus公司)。
1.2.1 載apatinib納米膠束的體外釋放實(shí)驗(yàn) 紫外光譜全波長(zhǎng)200~500 nm掃描apatinib在PBS中的紫外吸收曲線,得出apatinib的特征吸收峰在347 nm,再根據(jù)5組不同濃度對(duì)應(yīng)的吸收度繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。將10 mL的載apatinib膠束加入透析袋中(截留分子量:3 500),將透析袋兩段封緊后浸入50 mL的PBS(含0.2%SDS以滿足漏槽條件)緩沖溶液中(pH=7.4),置于37 ℃恒溫振蕩箱中振蕩(振蕩速度為100 r/min);分別于1、2、4、8、16、24、36、48、72 h等時(shí)間點(diǎn)從外液相緩沖溶液中取出5 mL緩沖溶液,同時(shí)補(bǔ)入5 mL的新鮮PBS緩沖溶液(含0.2%SDS)。對(duì)于取出的溶液,測(cè)試其在347 nm處的紫外-可見(jiàn)光譜吸光強(qiáng)度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度,最終得到載apatinib納米膠束所釋放出的apatinib的量。
1.2.2 載apatinib納米膠束的體外溶血實(shí)驗(yàn) 取大鼠血2 mL,4 ℃ 2 000 r/min離心5 min,而后利用冰PBS洗滌后離心5 min,如是3次。棄去上清液,加入PBS,制備成8%體積比濃度的紅細(xì)胞懸液。設(shè)計(jì)4組紅細(xì)胞懸液,分別加入載apatinib納米膠束使終濃度(以apatinib濃度計(jì)算)為10.0、5.0、2.5、1.25 μmol/L,另設(shè)計(jì)兩組分別加入PBS和Trixon-100以設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照組。放入37 ℃培養(yǎng) 30 min后4 ℃ 2 000 r/min離心 5 min。取各組上清液100 μL加入96孔板,并在自動(dòng)微板讀數(shù)儀測(cè)定414 nm的吸光度。
1.2.3 HUVECs正常培養(yǎng)及傳代 將1 mL 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到T-25培養(yǎng)瓶中,加4 mL完全型內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基(ECM,含BM、FBS、ECGS、P/S,配制比例為500:25:0.5:0.5)混勻;將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中;待細(xì)胞培養(yǎng)長(zhǎng)至90%~95%進(jìn)行傳代;將原ECM移除,用1 mL稀釋至0.125% 的胰酶消化3 min,后加入1 mL ECM終止消化,800 r/min 離心4 min,棄去上清液并加入1 mL ECM進(jìn)行重懸,而后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中并放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)所用原代細(xì)胞傳代均不大于7次。
1.2.4 HUVECs的饑餓及VEGF的誘導(dǎo)培養(yǎng) 利用ECM培養(yǎng)新傳代的HUVECs,待6 h細(xì)胞貼壁后,棄去原ECM,換用BM培養(yǎng)12 h進(jìn)行饑餓。待細(xì)胞饑餓完畢后,棄去BM,加入VEGF誘導(dǎo)培養(yǎng)基(VCM;含 BM、FBS、rhVEGF121、P/S,配制比例為500:5:0.5:0.5)進(jìn)行培養(yǎng)。
1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,制備成用ECM重懸、密度為5×105/mL的細(xì)胞懸液,以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板上,待細(xì)胞貼壁后,棄去原ECM并加入BM進(jìn)行饑餓12 h。待饑餓完畢后,加入VCM進(jìn)行VEGF誘導(dǎo)培養(yǎng)。而后每孔分別加入1 μL不同濃度的單純apatinib和載apatinib納米膠束,使終濃度(以apatinib的含量計(jì)算)分別為 10、5、2.5、1.25 μmol/L與 625、312.5、156.25 nmol/L;設(shè)立空白納米膠束(不載藥物的納米膠束)對(duì)照組:按上述濃度設(shè)計(jì)(以納米膠束的對(duì)應(yīng)含量計(jì)算)加入相同體積的空白納米膠束;設(shè)立空白對(duì)照組:加入等體積的PBS;培養(yǎng)至48 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,后用BIO-TEK自動(dòng)微板讀數(shù)儀測(cè)定450 nm的吸光度(A)。為研究載apatinib納米膠束對(duì)增殖的抑制與時(shí)間的關(guān)系,取1 μmol/L(以apatinib的含量計(jì)算)的載apatinib納米膠束及單純apatinib,加入按上述方法細(xì)胞鋪板并饑餓處理的96孔板內(nèi),連續(xù)培養(yǎng)3 d,分別設(shè)計(jì)12、24、36、48、60、72 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn),培養(yǎng)結(jié)束后加入10 μL CCK-8,4 h后測(cè)定吸光度。抑制率按如下公式進(jìn)行計(jì)算,抑制率(%)=(空白對(duì)照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/空白對(duì)照孔A值×100%。采用Bliss法計(jì)算 IC50。
1.2.6 HUVECs遷移實(shí)驗(yàn) 利用牛纖維蛋白包被Transwell小室并將小室放在37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 h對(duì)Transwell小室做預(yù)處理。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成利用BM重懸、密度為2×105/mL的細(xì)胞懸液,以每孔100 μL接種于Transwell小室的上腔內(nèi),設(shè)立實(shí)驗(yàn)組:在Transwell下腔加入VCM 500 μL,并按上述CCK-8實(shí)驗(yàn)步驟中的方法加入單純apatinib以及載apatinib納米膠束使藥物濃度(以apatinib的含量計(jì))為 10、1、0.1 μmol/L;設(shè)立VEGF誘導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照組:下腔內(nèi)只加入VCM以觀察VEGF誘導(dǎo)的遷移;設(shè)立FBS誘導(dǎo)對(duì)照組:下腔內(nèi)不加入VCM而只加入ECM以觀察FBS誘導(dǎo)的遷移;設(shè)計(jì)空白對(duì)照組:下腔內(nèi)加入BM。為探究載apatinib納米膠束釋放時(shí)間對(duì)遷移的影響,在下腔內(nèi)加入已釋放0、1、2、3 d的載apatinib納米膠束及單純apatinib,使藥物濃度(以apatinib的含量計(jì))為1 μmol/L,并按上述設(shè)立VEGF誘導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照組。在37 ℃含5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)12~24 h后,用90%乙醇固定30 min,完畢后利用結(jié)晶紫染色20 min。利用PBS清洗3次,每次5 min。而后在Olympus顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),每小室取5個(gè)視野。抑制率計(jì)算=(VEGF誘導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照孔-實(shí)驗(yàn)孔)/VEGF誘導(dǎo)陽(yáng)性對(duì)照孔×100%。
1.2.7 HUVECs小管成型實(shí)驗(yàn) 將50 μL Matrigel加入預(yù)冷的96孔板內(nèi)進(jìn)行包被并在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜進(jìn)行預(yù)處理。因單純的VEGF不能誘導(dǎo)HUVECs進(jìn)行體外小管成型[3],故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中將VCM內(nèi)的FBS含量提升至5%。設(shè)立實(shí)驗(yàn)組:制備以VCM重懸、密度為2×105/mL的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液,在各已被Matrigel包被的孔內(nèi)加入100 μL細(xì)胞懸液,并加入載apatinib納米膠束及單純apatinib,使藥物濃度(以apatinib 含量計(jì))為10、1 μmol/L;設(shè)立VCM陽(yáng)性對(duì)照組:加入PBS進(jìn)行處理VCM重懸的細(xì)胞懸液;設(shè)立空白對(duì)照組:各孔內(nèi)加入100 μL利用BM重懸的細(xì)胞懸液而不加入任何藥物;設(shè)立ECM對(duì)照組:各孔內(nèi)加入100 μL利用ECM重懸的細(xì)胞懸液而不加入任何藥物。為探究載apatinib納米膠束釋放時(shí)間對(duì)小管成型的影響,按上述方法加入VCM重懸的細(xì)胞懸液,并于各孔內(nèi)加入1 μmol/L單純apatinib及已釋放0、1、2、3 d的載apatinib納米膠束;按上述設(shè)立VCM陽(yáng)性對(duì)照組。在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后,利用倒置相差顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照,每孔拍攝5個(gè)視野。小管成型率計(jì)算=(VCM陽(yáng)性對(duì)照孔-實(shí)驗(yàn)孔)/VCM陽(yáng)性對(duì)照孔×100%。
體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示,載apatinib納米膠束的釋放率在前2 h達(dá)20.5%,后釋放逐漸減慢,至72 h后釋放率達(dá)到62.9%(圖1)。
圖1 載apatinib納米膠束的體外釋放Figure 1 Release of apatinib-loaded nanomicelles in vitro
體外溶血實(shí)驗(yàn)顯示,與Trixion-100可以引起明顯的溶血相比,所有載apatinib納米膠束組溶血率均<5%(均P<0.05)(圖2)。
圖2 載apatinib納米膠束的溶血實(shí)驗(yàn)Figure 2 Hemolysis tests of apatinib-loaded nanomicelles
CCK-8結(jié)果顯示,研究中所有設(shè)計(jì)的空載納米膠束組中,HUVECs增值率都在95%以上(均P>0.05)。單純apatinib及載apatinib納米膠束按apatinib藥物濃度10、5、2.5、1.25 μmol/L與625、312.5、156.25 nmol/L分別作用48 h之后,對(duì)HUVECs增殖的抑制率隨藥物濃度上升而增加(圖3A),此時(shí)載apatinib納米膠束對(duì)HUVECs增殖的抑制率平均仍然小于單純apatinib(IC50:1.385 μmol/L vs. 0.768 μmol/L,P=0.012)。但通過(guò)延長(zhǎng)作用時(shí)間并進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)試,在濃度同是1 μmol/L下,雖然載apatinib納米膠束組在作用開(kāi)始時(shí)弱于原藥apatinib組,但隨著時(shí)間延長(zhǎng),載apatinib納米膠束的抑制作用逐漸增加并于72 h接近并超過(guò)單純apatinib組(63.34% vs. 59.70%,P=0.005);且單純apatinib的抑制率初始抑制率增加很高,后隨時(shí)間變化逐漸趨于平緩,而載apatinib納米膠束抑制率穩(wěn)定增加(圖3B)。
為進(jìn)一步證明載apatinib納米膠束對(duì)HUVECs的抑制作用,本研究進(jìn)行了Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,載apatinib納米膠束及單純apatinib均可以抑制HUVECs的遷移,抑制能力隨藥物濃度上升而增加(圖4);隨著載apatinib納米膠束釋放時(shí)間變長(zhǎng),其對(duì)HUVECs遷移的抑制能力也會(huì)增強(qiáng)(圖5),且釋放3 d的apatinib納米膠束抑制遷移能力大于單純apatinib(P=0.005)。
圖3 載apatinib納米膠束與單純apatinib對(duì)HUVECs增殖的抑制作用 A:不同濃度的載apatinib納米膠束及單純apatinib作用48 h對(duì)HUVECs增殖的抑制率;B:1 μmol/L載apatinib納米膠束及單純apatinib作用不同時(shí)間對(duì)HUVECs增殖的抑制率Figure 3 Inhibitory effects of apatinib-loaded nanomicelles and free apatinib on proliferation of HUVECs A: Inhibition rates of various concentrations of apatinib-loaded nanomicelles and free apatinib on HUVECs at 48 h; B: Inhibition rates of 1 μmol/L apatinibloaded nanomicelles and free apatinib on HUVECs at different time points
圖4 不同濃度的載apatinib納米膠束及單純apatinib對(duì)HUVECs遷移的抑制 A:BM對(duì)照;B:ECM對(duì)照;C:VCM對(duì)照;D:apatinib 10 μmol/L;E:apatinib 1 μmol/L;F:apatinib 0.1 μmol/L;G:載 apatinib 納米膠束 10 μmol/L;H:載 apatinib納米膠束 1 μmol/L;I:載 apatinib 納米膠束 0.1 μmol/LFigure 4 Inhibitory effects of various concentrations of apatinib-loaded nanomicelles and free apatinib on migration of HUVECs A: BM control; B: ECM control; C:VCM control; D: 10 μmol/L apatinib; E: 1 μmol/L apatinib; F: 0.1 μmol/L apatinib; G: 10 μmol/L apatinib-loaded nanomicelles; H: 1 μmol/L apatinib-loaded nanomicelles; I: 0.1 μmol/L apatinib-loaded nanomicelles
圖5 1 μmol/L單純apatinib及1 μmol/L不同釋放時(shí)間的載apatinib納米膠束對(duì)HUVECs遷移的抑制 A:VCM對(duì)照;B:apatinib 1 μmol/L;C:1 μmol/L 載 apatinib 納米膠束釋放 0 d;D:1 μmol/L 載 apatinib 納米膠束釋放 1 d;E:1 μmol/L載apatinib納米膠束釋放2 d;F:1 μmol/L載apatinib納米膠束釋放3 dFigure 5 Inhibitory effects of 1 μmol/L free apatinib and 1 μmol/L apatinib-loaded nanomicelles with different releasing time on migration of HUVECs A: VCM control; B: 1 μmol apatinib L; C: 1 μmol/L 0-d releasing apatinib-loaded nanomicelles;D:1 μmol/L 1-d releasing apatinib-loaded nanomicelles; E: 1 μmol/L 2-d releasing apatinib-loaded nanomicelles; F: 1 μmol/L 3-d releasing apatinib-loaded nanomicelles
為模擬載apatinib納米膠束對(duì)腫瘤新生血管的抑制作用,本研究進(jìn)行了HUVECs成管實(shí)驗(yàn)。成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單純apatinib及載apatinib納米膠束均對(duì)HUVECs成管能力的抑制可隨濃度增加而增加;藥物濃度增加至10 μmol/L時(shí),單純apatinib可以使HUVECs成管能力完全消失,而載apatinib納米膠束即使達(dá)到10 μmol/L,對(duì)HUVECs成管能力的抑制依然不是很強(qiáng)(圖6);但隨著載apatinib納米膠束釋放時(shí)間延長(zhǎng),載apatinib納米膠束對(duì)HUVECs成管能力的抑制會(huì)逐漸增加,且釋放3 d的載apatinib納米膠束抑制遷移能力會(huì)超越單純apatinib(P=0.042)(圖7)。
圖6 不同濃度的載apatinib納米膠束及單純apatinib對(duì)HUVECs成管能力的抑制作用 A:VCM對(duì)照;B:apatinib 10 μmol/L;C:apatinib 1 μmol/L;D:載apatinib納米膠束10 μmol/L;E:載apatinib納米膠束1 μmol/LFigure 6 Inhibitory effects of various concentrations of apatinib-loaded nanomicelles and free apatinib on tube formation of HUVECs A: VCM control; B: 10 μmol/L apatinib; C: 1 μmol/L apatinib; D: 10 μmol/L apatinib-loaded nanomicelles; E: 1 μmol/L apatinib-loaded nanomicelles
圖7 1 μmol/L單純apatinib及1 μmol/L不同釋放時(shí)間的載apatinib納米膠束對(duì)HUVECs成管能力的抑制 A:VCM對(duì)照;B:apatinib 1 μmol/L;C:1 μmol/L 載 apatinib 納米膠束釋放 0 d;D:1 μmol/L 載 apatinib 納米膠束釋放 1 d;E:1 μmol/L載apatinib納米膠束釋放2 d;F:1 μmol/L載apatinib納米膠束釋放3 dFigure 7 Inhibitory effects of 1 μmol/L free apatinib and 1 μmol/L apatinib-loaded nanomicelles with different releasing time on tube formation of HUVECs A: VCM control; B: 1 μmol/L apatinib; C: 1 μmol/L 0-d releasing apatinib-loaded nanomicelles;D: 1 μmol/L 1-d releasing apatinib-loaded nanomicelles; E: 1 μmol/L 2-d releasing apatinib-loaded nanomicelles; F: 1 μmol/L 3-d releasing apatinib-loaded nanomicelles
晚期或者轉(zhuǎn)移性的胃癌預(yù)后往往較差,平均生存時(shí)間約為半年,在接受一線化療方案后,晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌患者可以延長(zhǎng)6個(gè)月左右的生存時(shí)間[1],但在一線化療方案不起作用的情況下,只能選用二線或三線化療治療方案(多西他賽、伊利替康或紫杉醇等),但平均生存時(shí)間往往也會(huì)減短[11]。血管新生在腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用[12],而VEGF/VEGFR-2通路是控制血管新生最重要的管理器[13],因此,VEGF/VEGFR-2通路可以作為以抑制血管新生而達(dá)到抗腫瘤目的的關(guān)鍵靶點(diǎn)。目前,已經(jīng)研究出的VEGF/VEGFR-2通路的抑制劑包括3類:特異性結(jié)合抗體、可溶性VEGF干擾分子及小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)[3]。apatinib作為小分子TKI,可通過(guò)特異性結(jié)合VEGFR2受體的酪氨酸激酶位點(diǎn),抑制磷酸化反應(yīng),從而抑制VEGF/VEGFR2信號(hào)通路產(chǎn)生的反應(yīng),進(jìn)一步抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,產(chǎn)生抗腫瘤的效果[14]。目前,apatinib在中國(guó)進(jìn)行II期和III期臨床試驗(yàn)后,已經(jīng)證明可以顯著改善晚期胃癌患者的生存時(shí)間[5-6]。在apatinib的兩個(gè)臨床試驗(yàn)內(nèi),apatinib明顯改善了晚期胃癌患者生存期,但也存在著較為明顯的副作用。這些高頻率的副作用可通過(guò)減藥或者停藥來(lái)改善,但也降低了apatinib的抗腫瘤效果[4-6,15]。近期的一項(xiàng)研究[7]表明:間斷使用抗VEGF治療可能誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移。因此,需要尋找一種能降低apatinib的副作用促使apatinib能夠長(zhǎng)期不間斷應(yīng)用的方法。分析apatinib導(dǎo)致副作用發(fā)生的原因,可能有兩種:⑴ apatinib具有新生血管區(qū)域靶向性,這種靶向性不僅使其作用于腫瘤新生區(qū)域,還作用于微血管較密集的區(qū)域比如黏膜、手足末端等,從而導(dǎo)致了并發(fā)癥;⑵ apatinib的部分癥狀可以通過(guò)減藥來(lái)實(shí)現(xiàn),可以推測(cè),非靶向部位過(guò)高釋放濃度的apatinib可能導(dǎo)致了并發(fā)癥的發(fā)生。因此,有必要尋求一種可以降低局部非靶向部位apatinib的濃度并且使apatinib具有緩釋性的方法。
納米技術(shù)與生命科學(xué)進(jìn)行了廣泛的交叉[16],新型的利用無(wú)毒高分子材料作為納米級(jí)藥物載體,已經(jīng)成為藥物研究領(lǐng)域重要的研究方向。由于腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的吞噬能力以及腫瘤等病變部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞縫隙遠(yuǎn)大于正常內(nèi)皮細(xì)胞間隙,因此當(dāng)納米膠束循環(huán)至腫瘤所在部位的時(shí)候其進(jìn)入腫瘤等病變部位的機(jī)會(huì)增多,同時(shí)納米膠束緩釋抗腫瘤藥物延長(zhǎng)了藥物在腫瘤內(nèi)的存留時(shí)間,減慢了腫瘤的生長(zhǎng),與游離藥物相比,延長(zhǎng)了藥效時(shí)間。因此,納米載藥系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)藥物緩釋作用的有效手段[17]。聚己內(nèi)酯(PCL)是一種半結(jié)晶性脂肪族聚酯,在生物安全性方面,聚己內(nèi)酯聚合物材料現(xiàn)已被證明具有良好的生物相容性,且已被美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用作生物醫(yī)用材料[18],但PCL由于結(jié)晶性強(qiáng)、熔點(diǎn)低、降解速率慢、缺乏反應(yīng)性官能團(tuán)等特點(diǎn),部分限制了其在生物應(yīng)用領(lǐng)域的應(yīng)用范圍,因而需要對(duì)其進(jìn)行改性[19]。單甲醚聚乙二醇(mPEG)于常態(tài)下比較穩(wěn)定,但其活性羥基端也可以在特殊條件下引起環(huán)狀物質(zhì)的開(kāi)環(huán)及聚合[20-23];此外,mPEG具有良好的生物降解性及優(yōu)越的生物相容性,其在生物體內(nèi)可以直接通過(guò)生物降解,且其本身具有免疫學(xué)惰性,在生物體內(nèi)引起免疫反應(yīng)的幾率較小[20,24],因此,mPEG對(duì)生物體影響較小,產(chǎn)生的毒性低[25]。因此,利用mPEG作為引發(fā)劑、誘導(dǎo)CL開(kāi)環(huán)合成的單甲醚聚乙二醇嵌段聚己內(nèi)酯材料(mPEG-b-PCL)是一種可用于載藥的安全有效的生物可降解材料。目前,mPEG-b-PCL已經(jīng)應(yīng)用于包載依托泊苷[26]、表柔比星[27]等化療藥物,也可以通過(guò)修飾后作為干擾RNA的靶向載體[28]。雖然有許多研究表明納米載藥系統(tǒng)應(yīng)用于改善化療藥物的藥效,但很少有研究表明納米載藥系統(tǒng)可用來(lái)改善抗血管生成藥物的藥效。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的利用納米載藥系統(tǒng)mPEG-b-PCL包載抗血管生成藥物apatinib,并對(duì)其進(jìn)行了緩釋性檢測(cè)及細(xì)胞學(xué)方面的研究。
本實(shí)驗(yàn)所使用的載apatinib納米膠束的最佳載藥率為16.21%,對(duì)應(yīng)的包封率為56.74%,平均粒徑(55.7±4.1)nm,呈球形、近單分散體系,具有穩(wěn)定的形態(tài)。根據(jù)納米載藥系統(tǒng)的緩釋性理論[8,17],載apatinib納米膠束可以持續(xù)緩慢釋放apatinib可能由于:載apatinib納米膠束由于逐步的水解作用或者緩慢的降解作用導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性破壞,從而使apatinib通過(guò)擴(kuò)散的方式釋放至膠束外部。為驗(yàn)證其緩釋性,本研究進(jìn)行了體外釋放實(shí)驗(yàn)。體外藥物緩釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:載apatinib納米膠束的釋放在前2 h達(dá)20.5%,說(shuō)明載apatinib納米膠束具有一定突釋作用,后釋放趨于平穩(wěn),至72 h后達(dá)到62.9%,這說(shuō)明載apatinib納米膠束具有良好的藥物緩釋作用。載apatinib納米膠束的緩釋性可能會(huì)延長(zhǎng)apatinib在腫瘤內(nèi)部的存留時(shí)間,與游離的apatinib相比,載apatinib納米膠束可以延長(zhǎng)apatinib的作用時(shí)間,減小apatinib的使用劑量[25]。載apatinib納米膠束的合成原料mPEG、PCL都具有良好的生物安全性及生物相容性[18,20,24],多項(xiàng)研究[25-28]表明:利用mPEG、PCL合成的納米材料mPEG-b-PCL安全性良好。為檢測(cè)mPEG-b-PCL是否可以安全地作為apatinib的載藥系統(tǒng),應(yīng)用于靜脈制劑,本研究進(jìn)行了體外溶血實(shí)驗(yàn)。體外溶血試驗(yàn)結(jié)果表明,高濃度的載apatinib納米膠束也不會(huì)引起細(xì)胞的溶血,這說(shuō)明載apatinib納米膠束具有較好的生物安全性;mPEG-b-PCL可以作為改善apatinib作用的納米材料。為了研究載apatinib納米膠束是否可以改善apatinib對(duì)新生血管抑制能力,本研究進(jìn)行了增殖及遷移實(shí)驗(yàn)。在Tian等[3]的研究中,apatinib對(duì)HUVECs增殖抑制的IC50為0.17 μmol/L,而本研究中的IC50為0.768 μmol/L,這可能是由于本研究與Tian等[3]的研究所使用的VEGF種類及含量不同導(dǎo)致。在48 h時(shí),單純apatinib對(duì)HUVECs增殖的抑制率仍然高于載apatinib納米膠束,根據(jù)前述緩釋性的研究,此時(shí)載apatinib納米膠束此時(shí)釋放的apatinib抑制能力仍然低于單純apatinib;而隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),載apatinib納米膠束對(duì)HUVECs增殖的抑制于72 h超越單純apatinib,這可能是因?yàn)閇8]:?jiǎn)渭僡patinib通過(guò)擴(kuò)散的方式進(jìn)入HUVECs內(nèi)部作用于VEGFR2的磷酸化位點(diǎn)[29];而載apatinib納米膠束既可以通過(guò)釋放出的apatinib的擴(kuò)散進(jìn)入HUVECs內(nèi)部,而且一部分載apatinib納米膠束可能可以被HUVECs通過(guò)胞吞作用進(jìn)入HUVECs內(nèi)部,兩者所釋放出的apatinib抑制能力超越單純apatinib。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,載apatinib納米膠束對(duì)HUVECs的遷移也可以產(chǎn)生抑制作用,且抑制能力表現(xiàn)出濃度依賴性及釋放時(shí)間依賴性;這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,載apatinib納米膠束可增加apatinib的利用率,改善apatinib對(duì)HUVECs的抑制作用。為了進(jìn)一步研究載apatinib納米膠束是否可以改善apatinib對(duì)新生血管抑制能力,本研究還進(jìn)行了體外小管成型實(shí)驗(yàn)來(lái)模擬體內(nèi)的微血管形成。10 μmol/L單純apatinib可以使HUVECs完全喪失成管能力,而10 μmol/L載apatinib納米膠束對(duì)HUVECs成管能力的抑制并不是很強(qiáng)甚至弱于1 μmol/L單純apatinib,這可能是因?yàn)槌晒軐?shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間為6 h[3],而此時(shí)載apatinib納米膠束大部分藥物尚未釋放的緣故。隨著釋放天數(shù)的延長(zhǎng),載apatinib納米膠束對(duì)HUVECs成管能力的抑制也會(huì)逐漸增強(qiáng),這與增殖與遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。以上實(shí)驗(yàn)表明了載apatinib納米膠束可以抑制血管的形成,也說(shuō)明了載apatinib納米膠束緩釋性及對(duì)apatinib進(jìn)行納米包載的可行性及優(yōu)越性。
綜上,載apatinib納米膠束良好的生物安全性、緩釋作用。本研究結(jié)果可以進(jìn)一步加深對(duì)藥物利用的理解,為抗血管生成藥物的研究提供新的思路和研究方法,也為以后腫瘤藥物的治療提供新的手段。
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