Saran Limbu，李瑞延，張彥博，秦彥國

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科，吉林 長(zhǎng)春130041)

TiN涂層生物活性及成骨誘導(dǎo)性研究

Saran Limbu，李瑞延，張彥博，秦彥國*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科，吉林 長(zhǎng)春130041)

鈦合金因其良好的生物相容性而被廣泛應(yīng)用于口腔及骨科臨床實(shí)踐[1-3]。但鈦合金往往表現(xiàn)出表面生物惰性，骨傳導(dǎo)性差，這一特性導(dǎo)致周圍骨組織難以和植入物材料形成骨性結(jié)合，最終造成無菌性松動(dòng)[4]。

通過對(duì)鈦合金表面進(jìn)行改性可以改變鈦合金本身惰性的這一弊端，促進(jìn)材料與骨組織直接結(jié)合促進(jìn)骨愈合[5,6]。目前有很多表面改性手段，如酸堿蝕刻、微弧氧化、物理沉積涂層等辦法[7,8]。而表面涂層技術(shù)在近些年的研究越發(fā)受到重視，因其可以保留原有基底材料的物理性能，又能提高其表面性能。

我們發(fā)現(xiàn)氮化鈦(TiN)是一種很好的涂層材料，TiN具有適宜的硬度，優(yōu)秀抗腐蝕性能和耐磨性能[9-11]。有趣的是TiN會(huì)逐步緩慢氧化，隨著O元素的加入，TiN的羥基磷灰石沉積能力得到明顯提高。而在模擬體液中的羥基磷灰石的沉積能力一定程度上反應(yīng)了材料的成骨活性?；谶@一前提我們假設(shè)TiN具有良好的生物活性和成骨活性，并對(duì)其進(jìn)行研究。我們通過磁控濺射技術(shù)在鈦合金表面噴涂一層TiN涂層，并通過體外骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)探究生物相容性及成骨誘導(dǎo)活性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(低糖DMEM，hygcone)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，胰酶、雙抗(青霉素鈉、鏈霉素)和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購置于美國Gibco公司。掃描電鏡(XL-30 ESEM FEG Scanning Electron Microscope， FEI COMPANY)，酶標(biāo)儀(Varioskan Flash,Thermo scientific)，細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2 材料制備

使用成分為Ti6Al4V的鈦片(TC4)作為基底，在其表面進(jìn)行磁控濺射TiN涂層處理。取胎兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖

將鈦片置于24孔板中，每孔接種細(xì)胞2萬個(gè)，每?jī)商鞊Q液一次，使用CCK-8試劑分別檢測(cè)1、4、7天的細(xì)胞增殖情況。檢測(cè)時(shí)CCK-8試劑與培養(yǎng)液比例為1∶10，37℃避光孵育2 h后在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

1.4 細(xì)胞形貌

鈦片放入24孔板中，細(xì)胞在鈦片上培養(yǎng)4天后，用電鏡固定液固定細(xì)胞。樣本經(jīng)梯度乙醇脫水，干燥后進(jìn)行噴金處理，最終在電鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.5 細(xì)胞活性

制備材料浸提液，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合時(shí)加入浸提液培養(yǎng)48 h，含5% DMSO的培養(yǎng)液用作對(duì)照，用CCK-8試劑檢測(cè)吸光度，對(duì)材料對(duì)細(xì)胞活性的影響進(jìn)行研究。

1.6 成骨能力檢測(cè)

將鈦片置于24孔板中，每孔接種10萬個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)液換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每?jī)商鞊Q液一次。分別在第14天用茜素紅對(duì)鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行染色。染色完成在體視顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)檢測(cè) 3 次，計(jì)量資料比較 采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本的組間比較采用 ANOVA，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖

如圖1所示為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在TiN和鈦合金表面培養(yǎng)1、4、7天的細(xì)胞增殖情況。可見TiN涂層在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞都多于鈦合金組，尤其是在第4、7天，TiN與鈦合金組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2 細(xì)胞黏附

如圖2所示,在TiN涂層及TC4均可看到生長(zhǎng)黏附的細(xì)胞。TiN涂層表面的細(xì)胞較伸展，較TC4組有更多的絲狀偽足伸展，這表明細(xì)胞處于活躍的生長(zhǎng)遷移狀態(tài)[12]。這一結(jié)果表明TiN表面更適合骨髓干細(xì)胞黏附。

圖1 骨髓干細(xì)胞在TiN涂層及鈦合金表面培養(yǎng)1、4、7天的細(xì)胞增殖情況

2.3 細(xì)胞活性

如圖3所示。TiN和鈦合金組細(xì)胞數(shù)量較多，與含5% DMSO組對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明TiN和鈦合金均無細(xì)胞毒性，具有較好的生物相容性。

2.4 成骨活性

茜素紅染色結(jié)果如圖4所示，TiN表面及鈦合金表面均有紅色的鈣結(jié)節(jié)沉積，而TiN鈣結(jié)節(jié)數(shù)量面積明顯高于鈦合金組。這表明TiN能夠明顯的促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。

圖2 細(xì)胞在TiN涂層及鈦合金表面的細(xì)胞

圖3 材料浸提液的細(xì)胞毒性檢測(cè)

3 討論

生物材料一直是近些年的研究熱點(diǎn)，同時(shí)具有良好生物相容性和成骨活性的材料對(duì)于骨科植入物來說至關(guān)重要。本研究成功通過磁控濺技術(shù)在鈦合金表面制備了TiN涂層。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，在長(zhǎng)達(dá)7天的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，TiN涂層組細(xì)胞數(shù)量一直高于鈦合金組，我們發(fā)現(xiàn)TiN涂層能明顯促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞黏附試驗(yàn)中，通過電鏡觀察TiN表面細(xì)胞處于良好的狀態(tài)，伸展出較多的絲狀偽足，這表明細(xì)胞處于活躍的生長(zhǎng)遷移狀態(tài)。

圖4 成骨誘導(dǎo)14天的茜素紅染色圖片

此外我們進(jìn)一步進(jìn)行了材料浸提液的細(xì)胞毒性研究，CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，TiN沒有細(xì)胞毒性。這些研究均表明TiN涂層具有良好的生物相容性，這對(duì)于生物材料來說非常重要。在成骨活性研究中，長(zhǎng)達(dá)14天的成骨誘導(dǎo)結(jié)果表明TiN能明顯的促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。這一結(jié)果說明TiN具有良好的成骨活性。

本研究成功通過磁控濺技術(shù)在鈦合金表面制備了TiN涂層。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和成骨活性研究對(duì)生物相容性和成骨活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明TiN具有良好的生物相容性和成骨活性。

[1]康浩方,馮穎芳.鈦合金植入物材料的表面改性研究進(jìn)展[J].鈦工業(yè)進(jìn)展,2003.20(Z1):53.

[2]馮穎芳.人工關(guān)節(jié)與鈦及鈦合金植入物材料[J].金屬學(xué)報(bào),2002,38(s1):539.

[3]Geetha MA，Asokamani SR.Ti based biomaterials,the ultimate choice for orthopaedic implants-a review[J].Progress in materials science,2009,54(3):397.

[4]王運(yùn)鋒,何 蕾,郭 薇.醫(yī)用鈦合金的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀[J].鈦工業(yè)進(jìn)展,2015，(1):1.

[5]徐 娟,胡 敏.鈦合金表面改性與骨結(jié)合能力的研究進(jìn)展[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013.11(2):119.

[6]Gepreel MAH,Niinomi M.Biocompatibility of Ti-alloys for long-term implantation[J].Journal of the mechanical behavior of biomedical materials,2013,20:407.

[7]吳全興.鈦及鈦合金在牙科領(lǐng)域應(yīng)用的新動(dòng)向[J].鈦工業(yè)進(jìn)展,2016,33(5):46.

[8]王之發(fā),王 艷,郭 繼,等.鈦及鈦合金種植體表面處理的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(31):6186.

[9]李愛霞.氮化鈦及其在口腔醫(yī)學(xué)中的研究和應(yīng)用[J].國際口腔科學(xué)雜志,2004.31(3):232.

[10]王 菁.鈦鑄件表面等離子氮化/鍍膜復(fù)合處理的表面性能及生物學(xué)研究[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2011.

[11]Piscanec S,CiacchiLC,Vesselli E,et al.Bioactivity of TiN-coated titanium implants[J].Acta Materialia,2004,52(5):1237.

[12]李廣文,宋艷艷,常 蓓,等.鈦表面微納米形貌對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)與成骨功能的影響[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2016.26(3):156.

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃國際科技合作項(xiàng)目(20150414006GH)； 吉林省省級(jí)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略調(diào)整引導(dǎo)資金專項(xiàng)項(xiàng)目(2014G072)

1007-4287(2017)03-0479-03

2016-11-19)

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