李 健，魏洪濤*，張國利，岳玉環(huán)，吳廣謀，田 園，邱麗娜，馬洪圓，王冬冬，吉元?jiǎng)?/p>

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科，吉林 長春130033；2.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

舌癌CAL-27細(xì)胞GnRHR的檢測及曲普瑞林對細(xì)胞增殖抑制作用研究

李 健1，魏洪濤1*，張國利2，岳玉環(huán)2，吳廣謀2，田 園2，邱麗娜1，馬洪圓3，王冬冬2，吉元?jiǎng)?

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科，吉林 長春130033；2.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

目的 研究I型促性腺激素釋放激素(GnRH-I)類似物(GnRHa)曲普瑞林(Triptorelin)對人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞株的體外增殖抑制作用。方法 利用RT-PCR方法檢測CAL-27細(xì)胞株GnRHR mRNA。Western Blot法檢測CAL-27細(xì)胞表面GnRHR蛋白表達(dá)。通過CCK-8法檢測曲普瑞林對CAL-27細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果 經(jīng)RT-PCR法檢測顯示CAL-27細(xì)胞存在GnRHR mRNA。Western Blot結(jié)果顯示， CAL-27細(xì)胞蛋白在60 kDa處存在GnRHR特異性反應(yīng)條帶。CCK-8檢測結(jié)果顯示，曲普瑞林對CAL-27細(xì)胞抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性，且差異顯著(P<0.01)。結(jié)論 舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞株中GnRHR基因及蛋白呈陽性，曲普瑞林對CAL-27細(xì)胞增殖具有抑制作用。

曲普瑞林；促性腺激素釋放激素受體；舌癌

(ChinJLabDiagn,2017,21:0475)

40%的頭頸部惡性腫瘤發(fā)生于口腔[1]，目前手術(shù)治療仍是主要的治療方式[2]。盡管聯(lián)用包括放化療在內(nèi)的多種治療方法，但預(yù)后仍然較差，5年生存率不到50%[3]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)口腔癌根治性治療對患者生活質(zhì)量有顯著的影響[4]。促性腺激素釋放激素(GnRH)是一種由下丘腦分泌的十肽激素，其調(diào)控垂體分泌促性腺激素的作用眾所周知。然而在過去的三十年中，逐漸發(fā)現(xiàn)GnRH及其受體除在垂體以及生殖系統(tǒng)存在，還存在于多種腫瘤組織中[5]。GnRH及合成的GnRH類似物已被證實(shí)對多種惡性腫瘤有抑制增殖的作用，包括卵巢癌、乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、胃癌、鼻咽癌等[6-11]。近年來，Cheung LW的研究顯示腫瘤細(xì)胞表面GnRHR與腫瘤的轉(zhuǎn)移及血管生成有關(guān)[12]。Lu等發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中GnRHR的表達(dá)量與預(yù)后顯著相關(guān)[13]。 這些均提示我們GnRH及GnRHR在腫瘤組織中的表達(dá)具有重要意義。迄今，尚未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外關(guān)于人口腔癌細(xì)胞或組織表達(dá)GnRHR的報(bào)道，本課題組檢測了人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞株GnRHR的基因及蛋白表達(dá)情況，并利用曲普瑞林針對GnRHR進(jìn)行了細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)，以期為提高口腔癌預(yù)后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞株購自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑、材料及儀器 曲普瑞林(Triptorelin，pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)委托蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。DMEM培養(yǎng)基以及新生牛血清購自GIBCO公司。總RNA提取試劑盒購自Promega公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司。GnRHR引物(F:5’-GCTCTCTGCGACCTTTA-3’;R:5’-TGTT CCACATCCCATCC-3’)及內(nèi)參基因β2-M引物(F:5’-GGGTTTCATCCATCCG ACATT-3’;R:5’-CACGGCAGGCATACTCATCTT-3’)委托長春庫美生物科技有限公司合成。CCK-8試劑盒購自DOJINDO公司。RIPA裂解液(強(qiáng))、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。鼠抗人單克隆抗體(ab22168)購自abcam公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司。PCR儀購自Bioer公司。核酸定量分析儀購自Thermo Fisher公司。凝膠圖像分析儀購自上海天能公司。多功能酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司。高速低溫離心機(jī)購自 Hettich公司。電泳槽、電泳儀電源、半干轉(zhuǎn)印儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞株使用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、飽和濕度、含5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 RT-PCR方法檢測CAL-27細(xì)胞株中GnRHR的mRNA 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫GnRHR及β2-M基因序列使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。取生長至80%匯合時(shí)的對數(shù)生長期細(xì)胞，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，核酸定量分析儀分析并定量顯示A260/A280值為1.9，濃度為253 ng/μl。使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。先去除基因組DNA，反應(yīng)體系為5×g DNA Eraser Buffer 2 μl、gDNA Eraser 1 μl、RNA 4 μl 、RNase Free dH2O 3 μl，共10μl 體系42℃加熱2分鐘后，與PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl、RT Primer Mix 1 μl、5×PrimeScript Buffer 2 4 μl、RNase Free dH2O 4 μl，組成20 μl 體系。37℃ 15 min、85℃5 s，4℃保存。取5 μl cDNA模板與1×Ex Taq buffer(含Mg2+)2 μl、Ex Taq 0.2 μl、上下游引物(10 μM)各0.5 μl、dNTP 1 μl、H2O 10.8 μl構(gòu)成20 μl擴(kuò)增體系。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)，72℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.6%瓊脂糖凝膠電泳。切膠回收后委托長春庫美生物科技有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序。

1.2.3 Western Blot檢測CAL-27細(xì)胞GnRHR蛋白表達(dá) 取生長至80%匯合時(shí)的對數(shù)生長期細(xì)胞，吸去細(xì)胞瓶內(nèi)舊培養(yǎng)基后使用無菌冰PBS清洗兩次。細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞至2 ml EP管內(nèi)2000 rpm離心5分鐘，棄上清。再用冷PBS清洗細(xì)胞2次，每次洗后離心。300 μl RIPA裂解液與3 μl PMSF(100 mM)混勻后加入至EP管，冰上裂解30分鐘后12 000 rpm離心10 分鐘，收集上清至新的預(yù)冷離心管。取適量蛋白溶液利用BCA法進(jìn)行濃度測定。

取40 μg蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，然后將蛋白半干轉(zhuǎn)移至NC膜上。含5%脫脂奶粉的TBST溶液37℃溫箱中封閉150分鐘。TBST洗膜3次每次5分鐘后，加入TBST稀釋(1∶1000)的鼠抗GnRHR單克隆抗體4℃孵育過夜。洗膜后，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶2000稀釋)室溫孵育2小時(shí)。洗膜后進(jìn)行DAB顯色。

1.2.4 利用CCK-8進(jìn)行細(xì)胞增殖分析 取生長至80%匯合時(shí)的對數(shù)生長期細(xì)胞，無菌PBS清洗兩遍，加入0.1%胰蛋白酶1.5 ml，37℃孵育4分鐘后去除胰蛋白酶。加入DMEM培養(yǎng)基吹打制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml，將細(xì)胞種植在96孔板中，每孔100 μl即10 000 個(gè)細(xì)胞。96孔板貼壁培養(yǎng)6小時(shí)后去除原培養(yǎng)基并加入用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的Triptorelin(10、20、40、80μg/ml)以及不含藥物的溶劑對照組培養(yǎng)48小時(shí)，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。48小時(shí)后去除舊培養(yǎng)基，統(tǒng)一更換新培養(yǎng)基，并設(shè)置不含細(xì)胞的培養(yǎng)基空白對照組，每孔加入10 μl CCK-8溶液37℃培養(yǎng)90分鐘后，利用酶標(biāo)儀檢測OD450，記錄檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔的OD450數(shù)值去掉一個(gè)最大值、一個(gè)最小值后取平均值，根據(jù)公式：細(xì)胞存活率=[(OD實(shí)驗(yàn)孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)]×100%計(jì)算細(xì)胞存活率，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以x—±s表示。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果

以CAL-27細(xì)胞cDNA為模板，擴(kuò)增GnRHR基因序列，對CAL-27細(xì)胞的GnRHR基因表達(dá)進(jìn)行初步檢測。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示GnRHR (167 bp)和內(nèi)參β2-M(160 bp)基因PCR擴(kuò)增結(jié)果無雜帶，經(jīng)膠回收后進(jìn)行測序，測序結(jié)果序列正確，證實(shí)CAL-27細(xì)胞存在GnRHR mRNA表達(dá)。見圖1。

M;TaKaRa DL2000 Marker;1:陰性對照 2:β2-M(160 bp);3:GnRHR(167 bp).

圖1 CAL-27細(xì)胞GnRHR與內(nèi)參基因PCR電泳圖

2.2 Western Blot檢測結(jié)果

結(jié)果顯示在60kDa處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，與其他文獻(xiàn)所報(bào)道的GnRHR蛋白大小一致，表明舌癌CAL-27細(xì)胞株存在GnRHR。見圖2。

M:Protein Marker;1:CAL-27細(xì)胞蛋白

2.3 細(xì)胞增殖-毒性檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的曲普瑞林(10、20、40、80μg/ml)處理CAL-27細(xì)胞48小時(shí)后使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞存活率來觀察曲普瑞林對CAL-27細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示隨曲普瑞林濃度增加，細(xì)胞存活率顯著降低 (F=11.535，P<0.001)，分別為(96.92±2.15)%、(93.03±2.35)%、(91.77±2.76)%、(88.62±2.39)%。10 μg/ml組與對照組相比較存活率差異無顯著性(P=0.128)，20、40、80 μg/ml組與對照組比較差異均具有極顯著性(P<0.01)。見圖3。

圖3 曲普瑞林處理CAL-27細(xì)胞48小時(shí)后的存活率

3 討論

近二三十年，得益于癌癥基因組學(xué)的發(fā)展，使癌癥靶向性治療成為可能。例如伊馬替尼可以特異性作用于BCR-ABL酪氨酸激酶，使其對慢性粒細(xì)胞白血病有較好的療效[14]。再如曲妥珠單抗特異性作用于HER2高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，阻斷HER2相關(guān)信號通路，使其成為目前HER2陽性乳腺癌患者主要靶向治療藥物[15]。GnRH激動(dòng)劑亦是一種靶向性藥物，目前已有曲普瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林應(yīng)用于臨床治療前列腺癌、乳腺癌、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位以及多種性激素相關(guān)疾病。曲普瑞林的氨基酸序列與I型促性腺激素釋放激素相比較，其第六位由色氨酸代替了天然序列中的甘氨酸。在人體內(nèi)，由于血清蛋白酶的裂解作用，GnRH-I的半衰期只有2-5分鐘，而包括曲普瑞林在內(nèi)的一系列的GnRH激動(dòng)劑都延長了半衰期并提高了與受體的結(jié)合力[16]。在對于前列腺癌的治療中，曲普瑞林是一線激素治療藥物，在臨床應(yīng)用中，對于晚期前列腺癌患者具有較好的療效和安全性[17]。本研究結(jié)果顯示人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞表面存在GnRHR，在人口腔癌細(xì)胞或組織中發(fā)現(xiàn)GnRHR的存在在國內(nèi)外尚屬首次。研究顯示，GnRHR在腫瘤組織中表達(dá)量很少[18]，本研究發(fā)現(xiàn)曲普瑞林對CAL-27細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴性關(guān)系，這可能與GnRH與其受體的高親和力有關(guān)。在垂體外腫瘤組織中，GnRH及其受體構(gòu)成了自分泌、負(fù)調(diào)控系統(tǒng)，使得其具有抗癌活性[19]。這一發(fā)現(xiàn)使得學(xué)者們對GnRH所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生濃厚興趣。Patrizia Limonta等人的研究發(fā)現(xiàn)，與垂體內(nèi)GnRH的信號通路不同，GnRH-I激動(dòng)劑不會(huì)影響PLC介導(dǎo)的磷脂酰肌醇代謝或細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。GnRH及其類似物與受體結(jié)合后，激活酪氨酸磷酸酶使癌細(xì)胞表皮生長因子受體去磷酸化[20]。目前我們尚不清楚GnRH及其類似物對口腔癌的抑制作用是否與此相關(guān)，未來我們將對此問題進(jìn)行深入探討。本研究對解釋體內(nèi)激素水平影響腫瘤組織的生長狀態(tài)有重要意義，這將有助于提升口腔癌的預(yù)后維護(hù)以及臨床新藥開發(fā)。

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The expression of GnRHR on CAL-27 cells and the inhibitory effect of Triptorelin on the proliferation of CAL-27 cells in vitro

LIJian,WEIHong-tao,ZHANGGuo-li,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To investigate the antiproliferation effect of GnRH-I analogue Triptorelin on human tongue squamous cell carcinoma cell line CAL-27 in vitro.Methods RT-PCR method was used for detection of gonadotropin releasing hormone receptor (GnRHR) mRNA in CAL-27 cell line.Western blot was employed to detect the expression of GnRH receptor on CAL-27 cells.CAL-27 cells were treated with different concentrations of Triptorelin for 48 hours and then OD450 was detected using CCK-8 assay to calculate the cell viability.Results The result of RT-PCR showed that CAL-27 cells have GnRHR mRNA.Western Blotting has showed that the protein samples of CAL-27 cells have specific reaction at approximately 60 kDa.CCK-8 detection showed a significant decrease in cell viability rate with the increase of concentration of Triptorelin (P<0.01).Conclusion CAL-27 cell line has the gene and protein expression of GnRH receptor .Our results demonstrate that Triptorelin has inhibitory effect on CAL-27 cells.

Triptorelin;Gonadotropin-releasing hormone receptor;Tongue cancer

吉林省自然科學(xué)基金(20160101095JC)

1007-4287(2017)03-0475-04

R739.86

A

2016-07-06)

*通訊作者