張 虎，李英姿，汪德州，宋文植，張?zhí)旆?/p>

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科,吉林 長春130033)

AuNCs@SiO2金納米簇復合粒子制備及其對體外口腔癌細胞毒性的研究

張 虎，李英姿，汪德州，宋文植*，張?zhí)旆?

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科,吉林 長春130033)

目的 制備一種具有熒光性的二氧化硅包覆金納米簇復合粒子，并研究其體外細胞毒性。方法 以牛血清白蛋白(BSA)介導合成金納米簇(BSA-AuNCs),改良St?ber法制備二氧化硅包覆的金納米簇復合粒子AuNCs@SiO2并表征,通過CCK-8細胞相容性實驗測試復合納米粒子對人舌鱗癌細胞CAL27，人口腔表皮樣癌細胞KB,小鼠胚胎成纖維細胞3T3的細胞毒作用。結(jié)果 AuNCs@SiO2復合金納米簇粒子在365 nm紫外燈下具有熒光性,透射電鏡顯示納米復合粒子為球形、粒度均勻的殼核型粒子,平均粒徑52.30 nm;紫外可見光吸收曲線顯示，與金納米簇相比較，氧化硅包覆的金納米簇復合粒子特征性吸收峰消失,熒光光譜顯示最大發(fā)射峰輕微藍移至655 nm處;CCK-8法結(jié)果顯示，不同濃度AuNCs@SiO2分別作用于細胞24 h，各劑量組與正常對照組相比較，細胞存活率差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 合成的金納米簇殼核復合粒子不僅保留了金納米簇的熒光特性，表層的硅殼還能夠提高金納米簇的熒光穩(wěn)定性，并且納米復合粒子對體外口腔癌細胞和小鼠3T3細胞無顯著細胞毒性。此種金納米簇復合粒子有望應用于口腔癌細胞的成像和治療領域。

金納米簇；St?ber 法；殼核復合粒子；細胞毒性； CCK-8

(ChinJLabDiagn,2017,21:0471)

近年來，具有高熒光強度特性的熒光納米顆粒在細胞標記領域得到廣泛應用[1]。貴金屬納米簇作為熒光納米材料之一，由幾到幾十個金屬原子組成，最常見的為金和銀納米簇。金納米簇具有粒徑極小、熒光信號強且穩(wěn)定、抗光漂白作用強、合成條件溫和、綠色無污染、毒性低等特點，使其在生物標記和細胞成像領域有巨大的吸引力[2,3]。以往報道認為金納米簇具有優(yōu)異的生物相容性[4,5]，然而近期研究顯示金納米簇能很快進入細胞，并在一定濃度范圍內(nèi)對不同細胞表現(xiàn)出不同程度的毒性[6]。因此本研究中我們采用改良St?ber法將金納米簇表面包覆一層具有良好表面修飾性的二氧化硅[7]，以期在保持其熒光性的同時改善其生物相容性，并采用CCK8法，研究AuNCs@SiO2納米復合粒子對人舌鱗癌細胞，人口腔表皮樣癌細胞,小鼠胚胎成纖維細胞的細胞毒作用，為該納米復合載體粒子在口腔醫(yī)學領域的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

實驗試劑：四氯金酸(HAuCl4·3H2O，國藥集團化學試劑有限公司)，氫氧化鈉(Na3C6H5O7·2H2O、 NaOH，美國Sigma公司)，氨水(NH3.H2O，國藥集團化學試劑有限公司)，乙醇(C2H5OH，北京化工廠)，以上試劑均為優(yōu)級純；高純水(Millipore Milli-Q純水儀新制)，DMEM/1640培養(yǎng)基(GIBCO，美國)，胰蛋白酶(DIFCO，美國 )，胎牛血清(TBD，中國)，正硅酸乙酯TEOS(分析純，北京化工廠)，使用前減壓蒸餾提純。

實驗儀器： SHIMADZUUV-1800紫外分光光度計(日本島津)， JEM-2010透射電鏡(日本電子)，MR3001磁力攪拌器(德國Heidolph),Nano Measurer 1.2測量軟件，RF-5301PC 熒光分光光度計(日本島津)，90Plus Zeta電位及粒度分析儀(美國，NanoBrook)，iMark酶標儀(BIO-RAD，美國)。

細胞株：人舌鱗癌細胞CAL27，人口腔表皮樣癌細胞KB,小鼠胚胎成纖維細胞3T3。

1.2 實驗方法

1.2.1 BSA-AuNC@ SiO2納米復合粒子的制備 參照文獻以牛血清白蛋白(BSA)介導合成金納米簇BSA-AuNCs[8]，首先單口燒瓶中加入25 ml BSA (50 mg/ml)溶液37℃水浴5 min，磁力攪拌下加入37℃ 25 ml HAuCl4(10 mM)，封口反應2 min。然后逐滴加入2.5 ml NaOH(1 M)，37℃恒溫反應12 h，可見溶液從淺黃變淺棕到深棕色改變。反應產(chǎn)物4℃避光保存。TEM觀察粒子形貌，測定其UV-vis 吸收光譜，熒光光譜。

改良St?ber法實現(xiàn)金納米簇表面二氧化硅層的包覆[9]。200 μl AuNCs 加入 19.2 ml無水乙醇，800 μl氨水混液中，超聲處理5 min，向體系中加入200 μl TEOS，磁力攪拌反應1 h，再加入200 μl TEOS，磁力攪拌反應24 h。9 000 rpm離心醇洗兩次，水洗兩次，得到氧化硅包覆的金納米簇復合粒子。所得樣品置于365 nm紫外燈下照射，TEM觀察粒子形貌，計算粒子粒徑，測定其UV-vis 吸收光譜，熒光光譜，粒子電位。

1.2.2 CCK-8法檢測BSA-AuNC@ SiO2納米復合材料體外細胞毒 取對數(shù)生長期的Cal27、3T3、KB細胞，胰蛋白酶消化，將細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度分別至(0.8×105)/(0.8×105/mL)/(1.0×105/mL) 個/mL接種于 96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，置于37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。PBS液洗細胞 1 次后，分別加入不含血清DMEM/1640培養(yǎng)液配制的納米材料溶液，使其終濃度分別為6.25 μg/mL、12.50 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100 μg/mL和200.00 μg/mL，正常對照組加無血清DMEM/1640培養(yǎng)液，每組 3 復孔。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，每孔加入 CCK-8 試劑 10 μl，繼續(xù)孵育 2 h，采用酶標儀檢測各孔在 450 nm 波長處的吸光度值，按以下公式計算計算各組細胞存活率。

細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。

注:A(加藥)：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度;A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度;A(0加藥)：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 AuNCs和AuNCs@SiO2納米材料紫外-可見吸收光譜

AuNCs和AuNCs@SiO2紫外-可見吸收光譜見圖1，顯示了BSA-AuNCs以及AuNCs@SiO2的紫外可見光吸收光譜。金納米簇的吸收峰在290 nm左右，主要受其表面BSA對紫外光吸收的影響。包硅后的復合納米粒子沒有特征性吸收峰。

圖1 AuNCs和AuNCs@SiO2紫外吸收光譜

2.2 AuNCs@SiO2納米復合粒子電鏡觀察

由透射電鏡照片(圖2)顯示AuNCs@SiO2納米復合粒子平均粒徑52.30 nm，為尺寸均一、球形的殼核型粒子，但無論在高濃度還是低濃度下，粒子均不是單分散性的，Zeta電位及粒度分析儀檢測可知其AuNCs@SiO2納米復合粒子表面帶有-34 mV電位，使其能夠抵抗聚集和沉淀，故本實驗制備的AuNCs@SiO2納米復合粒子在4℃冰箱可數(shù)星期保持穩(wěn)定呈溶膠態(tài)。良好的穩(wěn)定性是這種復合粒子進一步得到應用的前提。

圖2 殼核型的金納米團簇AuNCs@SiO2高濃度以及稀釋后溶液的透射電鏡圖×100000

2.3 AuNCs@SiO2納米復合粒子熒光性檢測

圖3為AuNCs和AuNCs@SiO2熒光光譜。熒光光譜結(jié)果顯示BSA-AuNCs 激發(fā)峰540 nm，發(fā)射峰660 nm,在660 nm光激發(fā)下，金納米簇有明顯的熒光發(fā)射峰，而實驗中單純的BSA溶液以及氯金酸溶液均沒有熒光發(fā)射，表明已成功地合成了金納米簇。當包覆SiO2層后，AuNCs@SiO2粒子最大發(fā)射峰發(fā)生輕微藍移至655 nm處，且強度較AuNCs有所降低。

圖4為金納米簇和AuNCs@SiO2金納米簇復合粒子在日光下及365 nm紫外燈光下照片，可以看出在365 nm紫外光照射下兩種粒子均發(fā)出明顯熒光，由于SiO2層的影響AuNCs@ SiO2熒光強度較AuNCs稍有減弱，與熒光光譜強度結(jié)果相對應。

圖3 AuNCs和AuNCs@SiO2熒光光譜圖(左側(cè)為最大吸收激發(fā)波長，右側(cè)為最大發(fā)射波長)

圖4 AuNCs和AuNCs@SiO2在日光燈和紫外燈照射下的照片，左側(cè)為AuNCs，右側(cè)為AuNCs@SiO2

2.4 AuNCs@SiO2納米復合粒子細胞毒性研究

我們采用CCK-8法檢測金納米簇復合粒子對人舌鱗癌細胞Cal27、小鼠成纖維細胞3T3、頭頸部鱗癌細胞KB細胞存活率的影響。結(jié)果表明，不同濃度AuNCs@ SiO2分別作用于細胞24 h后，隨著作用劑量的增加，細胞存活率改變不大，各劑量組與正常對照組相比較，差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度AuNCs@SiO2復合粒子作用下細胞存活率 (n=3,x—±s，%)

3 討論

熒光標記技術是細胞生物學領域重要研究手段之一，結(jié)合熒光顯微成像技術可以實現(xiàn)細胞及亞細胞生命過程可視化的監(jiān)測，檢測的靈敏度很大程度上取決于標記物的發(fā)光強度和穩(wěn)定性。袁媛等發(fā)現(xiàn)BSA介導合成的金納米簇可成功進入宮頸癌細胞，達到較好的活細胞熒光標記效果，且在經(jīng)過細胞固定化處理后仍保持其標記形態(tài)[10]。Chen等利用金納米簇修飾包被染料的硅殼形成納米復合物，用于檢測活細胞內(nèi)高活性氧，發(fā)現(xiàn)其具有高選擇性，高對比度，以及較高的胞內(nèi)運輸效率[11]。由于金納米簇粒徑極小，較難進行分離和純化[12]，我們采用改良St?ber法在其表面包覆一層SiO2，制備出的AuNCs@ SiO2納米復合粒子可以離心純化；金屬納米粒子的光學特性是由電子的表面振動產(chǎn)生的，被稱為表面等離子體共振。不同結(jié)構的金納米簇具有其特征性的吸收光譜，并且可以從它的特征吸收曲線進行區(qū)分[13]。包覆SiO2后粒徑變大，復合粒子的特征性吸收峰消失，可能是由表面SiO2層影響了BSA對紫外光的吸收導致的，此結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致[9]。

此種二氧化硅包覆的殼核結(jié)構復合粒子保留了原金納米簇的熒光特性，但發(fā)射峰輕微藍移，熒光強度略有降低，可能是因為金納米簇受表面硅層的影響性質(zhì)發(fā)生了一些改變，這種變化與以往文獻[14]報道中關于納米熒光染料在包硅后熒光光譜變化結(jié)果相類似。

由于氧化硅具有良好的表面可修飾性，故此種納米復合粒子可進一步在硅殼表層修飾藥物分子或其它功能性粒子，形成多功能納米復合粒子系統(tǒng)[15]，更重要的是，表面致密的硅殼能夠提高熒光性金納米簇的光穩(wěn)定性及化學穩(wěn)定性[16]， 為應用于生物醫(yī)學領域奠定良好基礎。

本研究所采用的CCK-8比色法是一種能夠快速進行藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗的比色方法，具有使用方便，靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好，對細胞毒性低等優(yōu)點，因此目前在國際上廣泛應用于免疫學、腫瘤學及醫(yī)用材料的生物相容性研究。通過CCK-8實驗觀察可以證實此種復合納米粒子對口腔癌細胞Cal27，KB以及小鼠3T3細胞均沒有明顯毒性。雖然此種納米復合粒子的合成和生物醫(yī)學應用尚在初期研究階段[17]，金納米簇復合粒子的表面修飾、進入細胞的方式和代謝方式仍需進一步研究，但此種AuNCs@ SiO2納米復合粒子在包括口腔癌在內(nèi)的惡性腫瘤細胞成像和治療領域已展現(xiàn)出有價值的應用前景.

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Preparation of silica-coated gold nanoclusters and its evaluation of oral cytotoxicity in vitro

ZHAGNHu,LIYing-zi,WANGDe-zhou,etal.

(Dept.ofStomatology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To prepare fluorescent silica-coated gold nanoclusters nanocomposite particles and evaluate the cytotoxicity in vitro.Methods Silica coated gold nanoclusters (AuNCs@SiO2)was prepared by modified Stober method and characterized by the transmission electron microscope,UV-VIS spectrophotometer,fluorescence spectrophotometer etc.The cytotoxicity on CAL27,KB and 3T3 cells in vitro was assessed by CCK-8 method.Results The AuNCs@SiO2nanocomposite particles emit red fluorescence under 365 nm UV light;TEM showed the mean effective diameter of the core-shell nanoparticles was approximately 52.30 nm with uniform,spherical shape.The absorption peak of the AuNCs@SiO2disappeared in UV-vis spectra;The fluorescence spectrum showed that the emission peak exhibited a slight blue shift to 655 nm;CCK-8 assay showed that after cultured with different concentration of AuNCs@SiO2for 24 hours,the survival rates of three kind of cells had no statistical difference compared with the control group.Conclusion The silica layer played protective role to the photostability of the fluorescent AuNCs，and the nanocomposite particles had no obvious cytotoxicity on oral cancer cells CAL27,KB and mouse embryo fiberblasts3T3.AuNCs@SiO2nanomaterial is promising in malignant neoplasm cell image including oral cancer.

AuNCs/modified Stober method/core-shell nanocomposite particles/oral cancer/CCK-8

國家自然科學基金項目(81372900);吉林省科技廳項目(20110708，20120713)

1007-4287(2017)03-0471-04

R780.1

A

2016-11-02)

*通訊作者