陰春霞,賈云霄,曲紅光,陳明星,辛精衛(wèi)*,金光華

(1.長(zhǎng)春市婦產(chǎn)醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;3.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 普外科)

Foxp3在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

陰春霞1,賈云霄1,曲紅光1,陳明星2,辛精衛(wèi)2*,金光華3

(1.長(zhǎng)春市婦產(chǎn)醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;3.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 普外科)

Foxp3(Forkhead box protein 3)是轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個(gè)成員，是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs) 特異的標(biāo)志物[1，2]。在一些腫瘤病人的腫瘤組織和外周血中均存在Foxp3表達(dá)增強(qiáng)和Tregs增多的現(xiàn)象[3，4]，其通過(guò)協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。而Foxp3是Treg發(fā)揮作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。本研究通過(guò)對(duì)宮頸癌、各級(jí)別的宮頸癌上皮內(nèi)瘤變(CIN)以及正常宮頸組織及血液中Foxp3 表達(dá)情況的分析,分析Foxp3在宮頸癌發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象和分組

選取2001- 2013年就診于長(zhǎng)春市婦產(chǎn)醫(yī)院接受婦產(chǎn)科手術(shù)治療病人的血液和術(shù)后石蠟標(biāo)本,其中CIN Ⅰ-Ⅱ級(jí)20份( CIN Ⅰ-Ⅱ級(jí)組),CINIII級(jí)20份( CINⅢ級(jí)組) ,宮頸癌60份(宮頸癌組),因?qū)m頸病變行宮頸錐切術(shù)術(shù)后病理明確為慢性宮頸炎的標(biāo)本20份(對(duì)照組)。CIN Ⅰ-Ⅱ級(jí)組病人的年齡30-65歲；CIN Ⅲ級(jí)組病人的年齡36-62歲；宮頸癌組病人的年齡39-62歲；對(duì)照組病人的年齡43-55歲。各分組之間年齡無(wú)明顯差別。宮頸癌組中鱗癌55例,腺癌5例；并根據(jù)2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期法分期。

1.2 方法

1.2.1 石蠟標(biāo)本Foxp3的檢測(cè) 入選蠟塊切片,進(jìn)行Foxp3免疫組織化學(xué)染色(SP法),由病理科有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師重新閱讀HE染色片,復(fù)核病理診斷及組織學(xué)分類。

1.2.2 血液標(biāo)本的處理 采集血樣立即室溫下提取淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 人血液中Foxp3的檢測(cè) 取1×106PBMC細(xì)胞懸液離心，甲醛固定后打孔，加入熒光標(biāo)記的Foxp3抗體標(biāo)記，4℃避光保存，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 采用雙盲法對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。Foxp3定位表達(dá)主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,鏡下呈棕黃色顆粒。半定量分析標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)陽(yáng)性的染色細(xì)胞為陰性(-)；0-25%為弱陽(yáng)性(+/-)；25%-50%為陽(yáng)性(+)；50%-75% 為中等陽(yáng)性(++)；>75%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.2.5 病例隨訪 首次手術(shù)時(shí)間定為隨訪開(kāi)始，所有病人均獲得完整隨訪資料。60例宮頸癌病人的中位生存時(shí)間是37個(gè)月(6-98個(gè)月)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn))。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxp3蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示(圖1),在對(duì)照組和CIN組中,Foxp3 表達(dá)并不明顯；而在宮頸癌組中,Foxp3表達(dá)的陽(yáng)性率為61.7%,與其他三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)(表1)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示在對(duì)照組和CIN組中,Foxp3 表達(dá)并不明顯;而在宮頸癌組中,Foxp3表達(dá)的陽(yáng)性率為60.0%,明顯高于對(duì)照組和CIN組(見(jiàn)圖2)。血液與組織中聯(lián)合表達(dá)Foxp3的陽(yáng)性率為45.0%明顯高于對(duì)照組和CIN組(表1)。

表1 Foxp3在各組內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)情況(n,% )

注:組間比較：P<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 組織中Foxp3蛋白的表達(dá)

圖2 血液中Foxp3的表達(dá)

2.2 宮頸癌病人Foxp3表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

檢測(cè)結(jié)果顯示,Foxp3表達(dá)僅與FIGO分期明顯相關(guān)(P=0.038)。而與其他臨床及病理學(xué)參數(shù)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。其中,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的11例病人中,血液中Foxp3陽(yáng)性表達(dá)病人占72.7%(8/11),組織中Foxp3陽(yáng)性表達(dá)病人占63.6%(7/11)，高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人(27.3%和36.4%)；而在宮頸鱗癌病人中,血液中Foxp3 表達(dá)陽(yáng)性的比例達(dá)60.0%(33/55),組織中Foxp3陽(yáng)性表達(dá)病人占63.6%(35/55)，高于宮頸腺癌病人中的比例(40.0%和36.4%),但上述差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 宮頸癌病人Foxp3表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系(n)

2.3 血液與宮頸癌組織Foxp3表達(dá)之間的關(guān)系

在癌組織中Foxp3陽(yáng)性表達(dá)的病人中血液Foxp3陽(yáng)性表達(dá)者占51.3%(19/37),血液中Foxp3陽(yáng)性表達(dá)的在組織Foxp3 陽(yáng)性組中亦高表達(dá)(47.2%,17/36),Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)提示二者存在正相關(guān)(P=0.017),表明組織及血液中Foxp3的表達(dá)具有協(xié)同表達(dá)的可能性。

3 討論

Foxp3作為Tregs行使功能的決定因子，參與局部免疫應(yīng)答，其功能過(guò)度發(fā)揮時(shí)反而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[3-6]。已有研究證實(shí)，在多種腫瘤病人外周血、腫瘤組織以及淋巴結(jié)中存在著Foxp3+數(shù)量的增加，腫瘤中Foxp3+Tregs的數(shù)量多少與腫瘤進(jìn)展程度和病人預(yù)后密切相關(guān)[7，8]。 關(guān)于Foxp3在宮頸癌腫瘤局部及血液中的表達(dá)尚缺乏系統(tǒng)的研究。Woo等[5]報(bào)道Foxp3+Tregs在非小細(xì)胞宮頸癌外周血表達(dá)增高。Schneider等[3]檢測(cè)到宮頸癌腫瘤標(biāo)本和淋巴結(jié)標(biāo)本中Foxp3的表達(dá)增多，并伴有NK細(xì)胞數(shù)目的減少。Shimizu等[4]采用免疫組化對(duì)100例非小細(xì)胞宮頸癌病人腫瘤組織標(biāo)本Foxp3的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)的Foxp3+Tregs數(shù)目與較差的無(wú)復(fù)發(fā)生存期密切相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤局部及血液中均存在Foxp3表達(dá)的增高，明顯高于CIN和正常對(duì)照組，且血液中Foxp3的表達(dá)與腫瘤局部的表達(dá)明顯相關(guān)。由此我們做出如下假設(shè)：在宮頸癌病人的血液中Foxp3表達(dá)增高，并在宮頸癌腫局部發(fā)揮作用，導(dǎo)致了癌灶局部免疫應(yīng)答減弱或缺失，促進(jìn)了腫瘤的免疫逃逸，導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另外CIN病人血液中及腫瘤局部的表達(dá)高于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一定程度說(shuō)明Foxp3參與宮頸癌的發(fā)生也是一個(gè)漸變的過(guò)程。

另外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3在宮頸癌腫瘤局部和血液的陽(yáng)性表達(dá)與宮頸癌FIGO分期相關(guān)，并在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人中的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說(shuō)明Foxp3誘導(dǎo)的免疫逃逸也參與了宮頸癌病人淋巴轉(zhuǎn)移的過(guò)程，并一定程度上提示病人不好的預(yù)后。由此我們認(rèn)為Foxp3在宮頸癌局部和血液的表達(dá)，尤其是血液中Foxp3的表達(dá)，可以作為一個(gè)輔助的評(píng)估病人疾病嚴(yán)重程度及術(shù)后隨訪的指標(biāo)。另外CIN病人血液中及局部也存在Foxp3一定程度的增高，從量變到質(zhì)變的角度考慮，通過(guò)生物靶向或免疫療法逆轉(zhuǎn)CIN病人Foxp3的高表達(dá)[9]，能否阻止CIN進(jìn)一步惡變?yōu)閷m頸癌甚至進(jìn)一步使CIN逆轉(zhuǎn)，有待于進(jìn)一步的研究。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們研究發(fā)現(xiàn)Foxp3在宮頸癌組織及血液中高表達(dá)，并與腫瘤的分期及生物學(xué)行為密切相關(guān)，而且Foxp3在腫瘤組織和血液中的表達(dá)顯著正相關(guān)，協(xié)同促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。由此我們認(rèn)為Foxp3的表達(dá)升高與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切,兩者既可作為宮頸癌的篩查、術(shù)前疾病評(píng)估和術(shù)后隨訪的輔助指標(biāo)，也為臨床靶向干預(yù)提供了理論依據(jù)。

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吉林省衛(wèi)生廳課題(2012Z136)

1007-4287(2017)03-0495-03

2016-04-17)

*通訊作者