周保貞,王大廣,鄭雷振,徐越超

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院,吉林 長春130021)

*通訊作者

胃癌患者血清中miR-204水平變化及與幽門螺桿菌感染的關(guān)系

周保貞,王大廣,鄭雷振,徐越超*

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院,吉林 長春130021)

幽門螺桿菌(Hp)感染已經(jīng)被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為第一類癌病致病原[1]。目前大量研究已證實(shí)Hp感染與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。微小RNA(miRNA)是一種單鏈RNA，目前研究認(rèn)為其具有非編碼性和高度保守性[2]。Calin[3]研究發(fā)現(xiàn)有超過半數(shù)的miRNA的基因所在區(qū)域與腫瘤有關(guān)，諸如雜合子缺失的微小區(qū)域、擴(kuò)增的微小區(qū)域和普通斷裂點(diǎn)，這些miRNA參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程。microRNA-204(miR-204)在不同腫瘤組織中存在異常表達(dá)，并與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、化療抵抗及不良預(yù)后密切相關(guān)[4，5]。此次研究擬通過檢測胃癌患者血清中miR-204表達(dá)水平，探討miR-204與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，并觀察其與Hp感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院胃結(jié)直腸外科2015年1月至2016年1月收治的94例胃癌患者作為觀察組，男53例，女41例，平均年齡(63.3±9.5)歲；100例慢性淺表性胃炎患者作為對照組，男55例，女45例，平均年齡(58.9±13.1)歲。兩組性別比例、平均年齡無顯著差異(P>0.05)。根據(jù)是否合并Hp感染將兩組分別分為胃癌-Hp感染亞組(GC-Hp亞組)、胃癌-Hp未感染組(GC-nonHp)亞組、對照-Hp感染亞組(C-Hp亞組)和對照-Hp未感染組(C-nonHp亞組)。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)胃鏡病理證實(shí)為胃腺癌，且均為首次診斷為胃癌；(2)近3個月未規(guī)律服用過抑酸藥、胃黏膜保護(hù)劑、非甾體類抗炎藥、抗生素[6]；(3)均行手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其它器官原發(fā)腫瘤；(2)合并免疫系統(tǒng)疾??；(3)重要器官(肝、腎等)功能不全；(4)有惡性腫瘤家族遺傳史；(5)接受過放療、化療、生物治療等。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)胃鏡病理證實(shí)為慢性淺表性胃炎；(2)近3個月未規(guī)律服用過抑酸藥、胃黏膜保護(hù)劑、非甾體類抗炎藥、抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)處于炎癥反應(yīng)急性期[7]；(2)有惡性腫瘤家族遺傳史；(3)合并免疫系統(tǒng)疾?。?4)重要器官(肝、腎等)功能不全。兩組及各亞組受試者基本資料無顯著差異(P>0.05)。此次研究通過吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院倫理委員會討論通過，實(shí)驗(yàn)前均向受試者告知實(shí)驗(yàn)過程，并簽署知情同意書1份。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清標(biāo)本采集 觀察組受試者于術(shù)前1天，對照組患者于行胃鏡檢查后3日清晨空腹用EDTA抗凝管取外周靜脈血5 ml，于2小時內(nèi)送檢。所有標(biāo)本經(jīng)1 200 g(3 000 r/min)離心15 min后，取上層清液3 ml作為標(biāo)本，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 血清miR-204水平檢測 按照試劑盒說明書提取標(biāo)本中的總RNA，并用分光光度計測量提取物在260 nm與280 nm處的吸光值，并以其比值(A260/A280)來衡量總RNA純度，當(dāng)A260/A280=2.0±0.1認(rèn)為純度滿意[8]。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置總體積為20 μl的反應(yīng)體系，此次研究選擇U6作為內(nèi)參，miR-204與U6的反轉(zhuǎn)錄引物序列分別為：miR-204：5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACG-

ACAGGCATA-3’；U6：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。將反應(yīng)體系按照：42℃ 1 h，85℃孵育5 min，合成cDNA。將cDNA用雙蒸水稀釋4倍后，應(yīng)用Light Cycler 2.0 實(shí)時定量PCR儀(購自Roche公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μl反應(yīng)體系為：稀釋后的cDNA 2 μl，Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2×) 10 μl，上、下游引物各0.5 μl，去RNA酶水7 μl。U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCTT-3’；miR-204上游引物序列：5’-GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3’，下游引物序列：5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性180 s，95℃變性15 s，60℃退火35 s，此為1個循環(huán)，共進(jìn)行40個循環(huán)。應(yīng)用相對定量法計算miR-204的相對表達(dá)量：2-ΔCT，ΔCT=CTmiR-204—ΔCTU6。CT為熒光信號達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù)。

1.2.3 Hp感染檢測方法 應(yīng)用C-13呼氣試驗(yàn)，受試者空腹或禁食3 h以上，口服13C尿素膠囊30 min后進(jìn)行呼氣試驗(yàn)。應(yīng)用紅外能譜儀對呼出氣13C原子峰進(jìn)行檢測，規(guī)定超出基線5%為Hp感染陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對計數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，對計量資料用t檢驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x—±s)的形式表示，應(yīng)用受試者工作曲線(ROC曲線)評價miR-204對胃癌的診斷價值，P<0.05有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 Hp感染檢測結(jié)果 觀察組94例患者中，Hp檢查結(jié)果陽性者71例，占75.53%，對照組100例患者中，Hp檢查結(jié)果陽性者43例，占43.00%。觀察組Hp感染率顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2 各組miR-204相對表達(dá)水平 觀察組血清miR-204相對水平為(0.424±0.127)，顯著低于對照組(1.306±0.271)(P<0.05)。GC-Hp亞組血清miR-204相對水平為(0.163±0.037)，顯著低于GC- nonHp亞組(0.619±0.264)(P<0.05)。C-Hp亞組血清miR-204相對水平為(0.899±0.158)顯著低于C-nonHp亞組(1.594±0.376)(P<0.05)。

2.3 胃癌患者血清miR-204水平與臨床資料的關(guān)系 胃癌患者血清中miR-204水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小和組織學(xué)分級無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 胃癌患者血清miR-204水平與臨床資料的關(guān)系

2.4 血清miR-204水平對胃癌的診斷價值 應(yīng)用受試者工作曲線對觀察組與對照組受試者血清miR-204水平進(jìn)行比較，得到miR-204診斷胃癌的ROC曲線。當(dāng)miR-204相對表達(dá)量為0.455時，曲線下面積(AUC)最大為0.839(95%CI：0.759-0.912)，靈敏度和特異度分別為73.4%與82.6%。見圖1。

圖1 血清miR-204表達(dá)水平ROC曲線

3 討論

幽門螺桿菌感染是慢性胃炎和萎縮性胃炎發(fā)病的危險因素這一觀點(diǎn)目前已被絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同。有研究發(fā)現(xiàn)，高水平Hp感染是由慢性-非萎縮性胃炎向慢性-萎縮性胃炎轉(zhuǎn)變，進(jìn)而發(fā)展為胃癌的促進(jìn)因素之一，但其具體機(jī)制尚不完全清楚。此次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者Hp感染率(75.53%)顯著高于慢性淺表性胃炎患者(43%)(P<0.05)。蔣曉玲等人[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，我國Hp感染率在40%-90%，與此次研究結(jié)果相似，這提示臨床工作中要注重對Hp感染的控制，而胃癌患者具有較高的Hp感染率，控制Hp感染是預(yù)防胃癌發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。

微小RNA是具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能的RNA，目前研究認(rèn)為miRNA的功能表達(dá)與細(xì)胞分化、增殖以及胞內(nèi)物質(zhì)能量代謝具有關(guān)聯(lián)[10]。Stik認(rèn)為[11]，miRNA與相應(yīng)的靶基因mRNA可以形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，從而抑制靶基因的表達(dá)。此次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miR-204水平顯著低于慢性淺表性胃炎患者，且GC-Hp亞組與C-Hp亞組受試者血清miR-204水平分別顯著低于GC-nonHp亞組與C-nonHp亞組(P<0.05)。這提示胃癌患者血清miR-204表達(dá)受到抑制。miR-204目前已探明具有抑癌作用[12]，而伴有Hp感染患者血清miR-204水平顯著降低，結(jié)合此次研究結(jié)果，提示Hp感染可能會抑制miR-204的表達(dá)，具體機(jī)制尚不清楚，可能與Hp分泌尿素酶、細(xì)胞空泡毒素等物質(zhì)[13]，刺激胃黏膜組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，激活免疫系統(tǒng)，抑制了miR-204的表達(dá)有關(guān)。此次研究表明，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Ⅲ-Ⅳ期胃癌患者血清miR-204水平顯著降低，這與劉洪建[14]、Zhang[15]等人的研究結(jié)果相似，這提示miR-204在胃癌的發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用。

此次研究還應(yīng)用ROC曲線對血清中miR-204水平對胃癌的診斷價值進(jìn)行了評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清中miR-204相對表達(dá)量為0.455時，其AUC最大，此時靈敏度為73.4%，特異度為82.6%。這提示血清miR-204水平對診斷胃癌具有一定的價值，但靈敏度較低，可以聯(lián)合其他檢查方法共同診斷。

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1007-4287(2017)03-0485-03

2016-05-28)