向 琳，宮美恒，王 蘋，尹萬忠，杜 波

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春130021)

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

向 琳，宮美恒，王 蘋，尹萬忠，杜 波*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春130021)

目的 從基因和分子水平探討頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)的發(fā)生機(jī)制。方法 從GEO數(shù)據(jù)庫下載人HNSCC相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)，使用BRB-Array Tools軟件篩選差異表達(dá)基因，采用DAVID、 ToppGene、STRING、Cytoscape工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果 BRB分析共篩選出263條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因134個，下調(diào)基因共129個，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)COL1A1、MMP9、COL1A2、COL3A1、MMP1等基因調(diào)節(jié)HNSCC細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、小細(xì)胞肺癌、腫瘤通路等，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。結(jié)論 利用生物信息學(xué)分析能有效挖掘基因芯片內(nèi)在數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探討HNSCC的發(fā)生機(jī)制提供理論參考。

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌；差異表達(dá)基因；基因芯片；生物信息學(xué)

(ChinJLabDiagn,2017,21:0381)

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)全球每年大約有500,000例新發(fā)患者[1]，新發(fā)病例死亡率約為20%[2]，尤其是鼻咽癌和下咽癌的死亡率更高[3]。HNSCC給患者及其家庭帶來沉重的生活負(fù)擔(dān)[4]。目前，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的分子機(jī)制仍不清楚，從基因水平研究HNSCC的發(fā)生發(fā)展，對其預(yù)防和治療具有重要意義。分子生物技術(shù)、多學(xué)科評估和準(zhǔn)確分期可能在未來診斷和治療HNSCC方面發(fā)揮重要作用[5]。生物信息學(xué)是一門交叉學(xué)科，通過聚類分析、通路分析等各種方法篩選大規(guī)?；蛐酒瑪?shù)據(jù)，挖掘出潛在的重要分子，理論上探討疾病的發(fā)病機(jī)制。本文采用BRB-Array Tools軟件篩選HNSCC差異表達(dá)基因，聯(lián)合其他生物信息學(xué)分析工具和數(shù)據(jù)庫，從基因和分子水平探討頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和正常組織基因芯片數(shù)據(jù)來源于GEO database數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)，登錄號為GSE29330和GSE6631。GSE29330由Demokan等[6]提交，研究中包括13例HNSCC標(biāo)本和5例正常組織標(biāo)本，芯片平臺采用Affymetrix GPL570(HG-U133_Plus_2)。GSE6631由Kuriakose等[7]提交，采用Affymetrix GPL8300(HG_U95Av2)芯片平臺，研究包括22例HNSCC標(biāo)本并配對22例正常組織標(biāo)本。

1.2 數(shù)據(jù)篩選與過濾 使用BRB-Array Tools(v4.5.0 stable)軟件(http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools/download.html)的MAS5.0解析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。點樣篩選的排除標(biāo)準(zhǔn)為直徑小于10的點樣，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化采用中位值法，基因篩選排除標(biāo)準(zhǔn)為：樣本表達(dá)中位值至少改變3倍以上，并且這種改變不少于20%樣本數(shù)，數(shù)據(jù)缺失不超過50%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 相同實驗對象基因差異表達(dá)分析采用配對t檢驗(隨機(jī)方差模型)，不同試驗對象基因差異表達(dá)分析采用獨立樣本t檢驗，顯著性水平為0.001，假陽性率為10%。

1.4 GO分析和KEGG通路分析 采用DAVID(v6.7)(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)在線工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO本體分析和KEGG通路分析，顯著性水平為0.01。

1.5 共表達(dá)分析 使用ToppGene(https://toppgene.cchmc.org/)在線工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行共表達(dá)分析，顯著性水平為0.01。

1.6 蛋白互作用網(wǎng)絡(luò) 采用STRING(v10.0)(http://string-db.org/)在線分析工具繪制差異表達(dá)基因編碼蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape(v3.3.0)軟件計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮匦浴?/p>

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選 采用BRB-Array Tools對GSE29330和GSE6631進(jìn)行分析后結(jié)果顯示：GSE29330數(shù)據(jù)中共篩選出258 個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)144個，下調(diào)114個(表1)。其中31條基因注釋不完整，利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫http://www.genecards.org/、http://www.ebi.ac.uk/和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/搜索相關(guān)基因信息后，對21條基因進(jìn)行了重新注釋，另外10條基因注釋未知，基因符合未能確定。GSE6631數(shù)據(jù)中共 93個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)46個，下調(diào)47個(表1)。Venny工具去除重復(fù)和注釋未知的基因后共獲得263條差異表達(dá)基因，其中上調(diào)134個，下調(diào)129個。

表1 人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌差異表達(dá)基因(部分)

2.2 GO分析 采用DAVID對263條差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示差異表達(dá)的基因主要分布在細(xì)胞外、質(zhì)膜，參與多細(xì)胞生物過程、發(fā)育過程，發(fā)揮蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合、受體結(jié)合、結(jié)構(gòu)活性分子等功能(表2)。

表2 差異表達(dá)基因的GO分析

2.3 KEGG通路分析 采用DAVID對263條差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏合斑、小細(xì)胞肺癌、腫瘤通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞色素P450外源性物質(zhì)代謝、藥物代謝、視黃醇代謝和糖酵解途徑等通路(表3)。

表3 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

2.4 共表達(dá)分析 使用ToppGene在線工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行共表達(dá)分析，結(jié)果顯示這些差異表達(dá)基因主要集中在早期人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌上調(diào)和下調(diào)功能基因中(表4)。

表4 差異表達(dá)基因的共表達(dá)分析

2.5 蛋白互作用圖 使用STRING在線軟件繪制差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)互作用圖，可見COL1A1、MMP9、COL1A2、COL3A1等處于中心地位，刪除這些關(guān)鍵節(jié)點后，蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)渙散(圖1)。將STRING繪制的蛋白質(zhì)互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，去除連接渙散的部分節(jié)點后，利用network analysis計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮匦?。結(jié)果顯示互作用網(wǎng)絡(luò)中共有120個節(jié)點，320條邊；最小度值為1，最大度值29，平均度值5.333±6.067；平均中介中間性為0.023，平均接近中心性為0.287。按照度值≥均數(shù)+1SD，中介中間性≥其平均值，接近中心性≥其平均值篩選核心節(jié)點，共篩選出COL1A1、MMP9、COL1A2等16個核心蛋白(圖2，表5)。

3 討論

頭頸部腫瘤約占所有惡性腫瘤的3%，其中90%是鱗狀細(xì)胞癌[4]。目前HNSCC的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，涉及多個基因、多條通路，呈現(xiàn)出復(fù)雜的生物學(xué)行為?；蛐酒捎谄涓咄?、快速檢測的特點在基因表達(dá)譜分析、基因測序、疾病診斷等方面發(fā)揮著重要作用，生物信息學(xué)就是通過各種分析處理數(shù)據(jù)的方法，挖掘基因芯片數(shù)據(jù)的內(nèi)在信息。

本研究通過生物信息學(xué)方法對基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)263條差異表達(dá)基因，涉及多條作用通路，參與HNSCC的上調(diào)和下調(diào)。共發(fā)現(xiàn)16個關(guān)鍵作用基因，其中關(guān)于COL3A1的研究較少，最新一篇發(fā)表在PLoS One的研究證實PDGFRβ是口腔鱗狀細(xì)胞癌新的腫瘤標(biāo)志物。膠原相關(guān)基因COL1A1、COL1A2和COL3A1在口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中高表達(dá)[8]。COL1A1、COL1A2和COL3A1參與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路和黏合斑。研究發(fā)現(xiàn)ECM受體相互作用和黏合斑在口腔鱗狀細(xì)胞癌被顯著激活[9]。細(xì)胞粘附是二者發(fā)揮作用的基礎(chǔ)[10]，細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)粘附在腫瘤的發(fā)生中起到顯著作用[11]。通過細(xì)胞粘附細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ITGA2 是一種I型膠原受體，它通過激活NF-κB配體表達(dá)明顯抑制細(xì)胞粘附，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生[12]。NF-κB配體激活誘導(dǎo)HNSCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成，與腫瘤分化程度相關(guān)[13]。I型膠原可能通過NF-κB促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生成。本研究發(fā)現(xiàn)FN1涉及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏合斑、小細(xì)胞肺癌、腫瘤通路4條通路。Yen等[14]研究發(fā)現(xiàn)FN1可能是評價口腔鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的標(biāo)志物，其靈敏度/特異性可達(dá)80%/84%。FN1能使FAK磷酸化導(dǎo)致VEGF-C高表達(dá)，通過下游信號分子活化口腔鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15]。本研究發(fā)現(xiàn)COL4A1在HNSCC組織中高表達(dá)，Tanaka等[16]研究發(fā)現(xiàn)COL4A1的差異表達(dá)還與癌細(xì)胞侵襲能力相關(guān)。Kwon等[17]研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)ITGA6的表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和集落形成。本研究中，相關(guān)基因上調(diào)激活細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等細(xì)胞通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

圖1 差異表達(dá)基因蛋白互作用圖

圖2 蛋白互作用圖中的核心節(jié)點

表5 核心蛋白列表

GenesDegreeBetweennessCentralityClosenessCentralityCOL1A1290.075922560.40753425MMP9270.186480270.43911439COL1A2250.03926630.39144737COL3A1230.052821610.39403974MMP1220.17081790.42805755FN1170.085678290.38263666TNC170.083465880.38636364POSTN170.045917650.39273927SERPINE1150.038466830.38762215MMP3140.070641640.39403974LOX140.06596690.37777778ITGA6140.05477970.371875SPP1130.042702960.36842105ITGB6130.023331580.33903134MMP13120.050263810.36060606LUM120.035058590.34293948

本研究中下調(diào)基因主要參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞色素P450外源性物質(zhì)代謝、藥物代謝等通路，CYP3A5顯著富集在細(xì)胞色素P450外源性物質(zhì)代謝、藥物代謝通路。Scheer等[18]敲除小鼠CYP3A5基因后發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟的解毒能力明顯下降。煙草影響CYP3A5和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性，導(dǎo)致不同個體頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)展的風(fēng)險，這可能與降低細(xì)胞色素P450外源性物質(zhì)代謝通路和藥物代謝通路活性有關(guān)[19]。

共表達(dá)分析中，所有差異表達(dá)基因主要集中在早期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌上調(diào)或下調(diào)基因集中，GO分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因主要分布在細(xì)胞外、質(zhì)膜，主要參與細(xì)胞的生長發(fā)育過程，這些差異表達(dá)基因能促進(jìn)或抑制HNSCC的增殖、侵襲。因此，探討HNSCC差異表達(dá)基因的作用通路，了解HNSCC發(fā)病的分子機(jī)制，可為腫瘤診斷與治療找到一些標(biāo)志分子。蛋白-蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)中，COL1A1、MMP9、COL1A2占據(jù)最核心位置。MMP9可能通過上皮-間質(zhì)特異性炎癥通路介導(dǎo)鱗狀細(xì)胞癌的侵襲，與高TNM分期相關(guān)[20]。MMP9水平與腫瘤臨床病理特征相關(guān)，但是并不能作為診斷預(yù)后的標(biāo)志物[21]。因此，還需要進(jìn)一步的研究尋找相關(guān)腫瘤標(biāo)志物?？傊蒙镄畔W(xué)分析能有效挖掘基因芯片內(nèi)在數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探討頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制提供理論參考。

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Bioinformatics analysis of head and neck squamous cell carcinoma

XIANGLin,GONGMei-heng,WANGPing,etal.

(DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,TheFirstHospitalofJinlinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To investigate the mechanism of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) from the gene and molecular level.Methods Download HNSCC related genes microarray data from GEO database,Screening differentially expressed genes using BRB-Array Tools software.Bioinformatics analysis was carried out using DAVID,ToppGene,STRING and Cytoscape tools.Results Two hundred and sixty-three differentially expressed genes,134 up-regulated and 129 down-regulated,were screened out by BRB.The COL1A1,MMP9,COL1A2,COL3A1,MMP1 gene,etc regulated ECM-receptor interaction,small cell lung cancer and pathways in cancer.Conclusion The use of bioinformatics to analyze microarray data can provide theoretical reference for in order to further explore the mechanism of HNSCC.

head and neck squamous cell carcinoma;differentially expressed genes;gene chip;bioinformatics

國家自然科學(xué)基金子課題(81372900)

1007-4287(2017)03-0381-05

R739.91

A

2016-12-23)

*通訊作者