范萬澤，薛應鈺，張樹武，徐秉良

(甘肅農業(yè)大學 植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070)

拮抗放線菌ZZ-9菌株發(fā)酵液的抑菌譜及穩(wěn)定性測定

范萬澤，薛應鈺，張樹武，徐秉良

(甘肅農業(yè)大學 植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070)

為探究拮抗放線菌ZZ-9 (Streptomycesrochei)菌株發(fā)酵液的抑菌譜，并明確傳代培養(yǎng)、溫度、光照、pH及紫外線等理化因素對發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響。以15種植物病原真菌為供試菌，采用菌絲生長速率法測定發(fā)酵液的抑菌譜，并以蘋果樹腐爛病菌(Cytosporasp.)為指示菌，測定不同條件下發(fā)酵液的穩(wěn)定性。抑菌譜結果表明：ZZ-9菌株發(fā)酵液對供試的15種病原真菌均具有不同程度的抑制作用，其中對蘋果樹腐爛病菌和立枯絲核菌抑制效果最好，生長抑制率可達96%以上，且效果持久；而對蘋果輪紋病菌、蠶豆褐斑病菌、月季葉霉病菌等抑制效果較差，抑制率在27%以下。穩(wěn)定性試驗結果表明：菌株傳接6代時，活性穩(wěn)定，從第7代開始菌株活性下降顯著；發(fā)酵液耐高溫，對強酸強堿處理、可見光及紫外線照射均有較好的穩(wěn)定性；且在4 ℃及室溫(20～25 ℃)下可貯藏至少30 d而保持其抑菌活性幾乎不變。因此，拮抗放線菌ZZ-9菌株次生代謝產物具有較廣譜的抑菌活性和較強的穩(wěn)定性，具有開發(fā)成微生物農藥的潛力。

拮抗放線菌；發(fā)酵液；抑菌譜；穩(wěn)定性

中國是世界上農藥和化肥污染最嚴重的國家之一，化學農藥的濫用不僅對生態(tài)環(huán)境、人類健康產生影響，而且易造成病蟲害抗性等問題。開發(fā)新型生物農藥、減少和替代高毒高殘化學農藥是發(fā)展綠色、安全農產品的必要條件[1]。微生物農藥因污染小、廣譜性，與環(huán)境相容等特點符合綠色農業(yè)的發(fā)展要求而被深入研究[2]。放線菌作為一種重要的微生物農藥資源而倍受關注，其次生代謝產物在低濃度時被用來防治病、蟲、草害或調節(jié)植物生長發(fā)育[3]。目前，已有多個商品化的產品被應用于生產。例如，被用來殺蟲的有阿維菌素、多殺菌素和南昌霉素；被用來殺菌的有放線菌酮、春雷霉素、萬隆霉素、多效霉素 、井岡霉素、農抗120以及多抗霉素、中生菌素、寧南霉素等；被用來除草的有雙丙氨膦等[4-7]。因此，從放線菌及其次生代謝產物中篩選廣譜、穩(wěn)定及低毒的農用抗生素具有十分廣闊的前景。

由于放線菌產生的活性物質在自然環(huán)境中大多不穩(wěn)定，從而影響放線菌的開發(fā)與應用。農用抗生素在施用到作物表面，或者進入到土壤中，都要受到光照、溫度、土壤酸堿性等的影響。因此，農用抗生素在各種環(huán)境條件下的穩(wěn)定性是評價其是否具有開發(fā)價值的一個重要指標[8]。甘肅農業(yè)大學植物病原實驗室從甘肅隴東地區(qū)采集的土壤中分離獲得一株拮抗放線菌，菌株編號ZZ-9，前期研究結果表明，放線菌ZZ-9對蘋果樹腐爛病菌(Cytosporasp.)具有較高抑菌活性，不同稀釋倍數(shù)的ZZ-9發(fā)酵濾液對腐爛病菌分生孢子萌發(fā)及菌絲生長均有明顯的抑制作用，其中50倍發(fā)酵濾液對孢子萌發(fā)抑制率和菌絲生長抑制率均達80%以上，且受抑制菌絲顏色加深，分支增多，末端膨大、畸形，出現(xiàn)原生質濃縮與釋放現(xiàn)象。通過形態(tài)學和分子生物學特征初步鑒定該菌為婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)。關于婁徹氏鏈霉菌防治植物病害的例子已有相關報道[9-10]，但關于其發(fā)酵液的抑菌譜及穩(wěn)定性的研究鮮見報道。本研究通過菌絲生長速率法測定菌株ZZ-9發(fā)酵液的抑菌譜范圍及不同條件下抑菌活性物質的穩(wěn)定性，以期為該拮抗菌的進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 放線菌ZZ-9(Streptomycesrochei)分離自甘肅省平涼市莊浪縣朱店鎮(zhèn)(N35°07′28.88″，E105°57′44.10″) 蘋果樹根際土壤，接種于高氏一號試管斜面，于4 ℃保存。

1.1.2 供試病原菌 蘋果樹腐爛病菌(Cytosporasp.)及14種供試植物病原真菌：立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、荷蘭豆枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、黃瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporum)、辣椒葉斑病菌(Phaeoramulariacapsicicol)、油菜根腐病菌(Fusariumsemitectum)、蘋果霉心病菌(Trichotheciumroseum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)、景天葉斑病菌(Alternariaalternata)、月季葉霉病菌(Cladosporiumcladosporioides)、蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriapiricola)、甘藍黃葉病菌(Fusariumsp.)、楊樹潰瘍病菌(Dothiorellagregaria)、蠶豆褐斑病菌(Ascochytafabae)，由甘肅農業(yè)大學植物病原實驗室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基：①種子發(fā)酵培養(yǎng)基為高氏一號液體培養(yǎng)基；②基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為小米浸汁培養(yǎng)基[11](小米10.0 g，葡萄糖10.0 g，蛋白胨3.0 g，氯化鈉2.5 g，碳酸鈣2.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4)。

1.2 發(fā)酵液的制備

首先將篩選純化的ZZ-9菌株[12]接種于高氏一號平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d。挑取已活化好的ZZ-9菌株到裝有60 mL種子發(fā)酵培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，制成種子液；然后再按10% 的接種量接入到裝液量為80 mL的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中(150 mL三角瓶)，28 ℃、180 r/min，振蕩培養(yǎng)4 d后，在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心20 min，用0.22 μm微孔濾器過濾其上清液，既得無菌發(fā)酵濾液，存于4 ℃冰箱，備用。

1.3 菌株ZZ-9發(fā)酵液的抑菌譜測定

采用菌絲生長速率法[13]，取2 mL無菌發(fā)酵液與18 mL冷至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿內制成帶藥平板，冷卻后在平板中央接入倒置的供試植物病原真菌菌餅(d=5 mm)，每處理3次重復。28 ℃恒溫培養(yǎng)，以加入無菌水的處理作對照，用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算生長抑制率[14]。計算公式為：

生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5)×100%

1.4 菌株ZZ-9發(fā)酵液的穩(wěn)定性測定

以蘋果樹腐爛病菌為指示菌，用菌絲生長速率法測定菌株ZZ-9無菌發(fā)酵液在不同條件處理后的抑菌活性。以無菌水和未經處理的發(fā)酵液原液為對照，每處理3次重復。

1.4.1 ZZ-9的傳代穩(wěn)定性 將放線菌ZZ-9菌株在高氏一號試管斜面上每隔1 d轉管1次，連續(xù)轉管10次，將每次轉管后的菌株再轉接到高氏平板上擴大培養(yǎng)，同時觀察各代菌株的培養(yǎng)特征，并測定其發(fā)酵液的抑菌活性。

1.4.2 熱穩(wěn)定性 將25 mL無菌發(fā)酵液于20、40、60、80、100、121 ℃分別處理30和60 min，測定活性，根據(jù)抑菌活性的變化確定其發(fā)酵液的穩(wěn)定性。

1.4.3 酸堿穩(wěn)定性 將25 mL無菌發(fā)酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 分別調整pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0后，再分別做2個試驗[15]。試驗(1)：將上述調節(jié)好pH的樣品在室溫下靜止放置12 h后，分別將其調至原發(fā)酵液pH(pH 7.6)，測定活性；試驗(2)：將上述調節(jié)好pH的樣品在100 ℃水浴中分別加熱30和60 min后，測定抑菌活性，根據(jù)抑菌活性的變化確定其發(fā)酵液的穩(wěn)定性。

1.4.4 可見光、紫外光穩(wěn)定性 將25 mL無菌發(fā)酵液置于無菌培養(yǎng)皿中，在4 000 lx 的光照箱中和波長為254 nm的紫外燈下25 cm處，分別照射1、2、4、8、16 h后再加蒸餾水還原至初始體積[16]，分別測定活性，根據(jù)抑菌活性的變化確定其發(fā)酵液的穩(wěn)定性。

1.4.5 貯藏穩(wěn)定性 取無菌發(fā)酵液各25 mL分別裝入已滅菌的50 mL三角瓶中，密封后，分別在室溫下和4 ℃冰箱中避光保存，在保存5、10、15、20、25、30 d時分別測定活性，根據(jù)抑菌活性的變化確定其發(fā)酵液的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 菌株ZZ-9發(fā)酵液的抑菌譜

由圖1可知，菌株ZZ-9發(fā)酵液對供試的15種植物病原真菌均具有不同程度的抑制作用。其中對蘋果樹腐爛病菌和立枯絲核菌的抑制效果最好，菌絲生長抑制率分別可達96.67%和98.75%；對黃瓜枯萎病菌、荷蘭豆枯萎病菌、番茄灰霉病菌、辣椒葉斑病菌這4種病原真菌的抑制率均在50%以上；對蘋果霉心病菌、菜豆炭疽病菌、油菜根腐病菌的抑菌率也在40%左右；而對蘋果輪紋病菌、蠶豆褐斑病菌、月季葉霉病菌等抑制效果較差，其中對蠶豆褐斑病菌的抑制率僅為15.27%(表1)。

圖中字母分別代表的病原菌種類見表1 Upper letters in Fig 1 reprent pathogens

表1 放線菌ZZ-9菌株發(fā)酵液抑菌譜Table 1 Testing of fermentation broth of actinomycete strain ZZ-9 against pathogenic fungus

注：供試樣品濃度為發(fā)酵液稀釋10倍，數(shù)據(jù)為3次重復的平均值。

Note:Concentrations of samples was fermentation broth diluted by 10 times;the data were average of three repetitions.

2.2 菌株ZZ-9發(fā)酵液的穩(wěn)定性

2.2.1 菌株ZZ-9傳代多次后穩(wěn)定性 將菌株ZZ-9連續(xù)轉管10次，然后將各代菌株在高氏一號平板上擴大培養(yǎng)后，其培養(yǎng)特征與初始菌株具有相同的性狀表現(xiàn)，氣生菌絲豐富，呈鼠灰色，基內菌絲呈灰白色或淺黃色，且均無色素產生。說明菌株在傳代的過程中培養(yǎng)特征較穩(wěn)定；從抑菌活性方面，菌株ZZ-9連續(xù)轉接6代后，其發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病菌的抑制率幾乎不變，第6代時抑制率仍為96.37%，各代菌株間在P=0.05水平上差異不顯著。第7代菌株抑制率為86.71%，與前6代菌株相比，其抑制率下降約10%，存在極顯著差異。從第7代開始到第10代，菌株活性略有下降但不明顯(圖2)。由此可知，該拮抗菌株前6代有較好的傳代穩(wěn)定性，從第7代后抑菌活性下降明顯，菌株活性相對穩(wěn)定。

不同小寫英文字母表示在0.05 水平差異顯著。下同 Bars with different letters mean significant differences at 0.05 level. The same as following

2.2.2 菌株ZZ-9發(fā)酵液的熱穩(wěn)定性 由圖3可知，菌株ZZ-9發(fā)酵液，在不同溫度下分別處理30和60 min后，對蘋果樹腐爛病的抑制率仍然可達96%左右，與對照相比差異不顯著。121 ℃下分別處理30和60 min后，菌絲生長抑制率較對照分別僅下降1.5% 和2.0% 左右，較20 ℃處理下降不超過2.5%。試驗結果還表明，在同一處理溫度下，隨著處理時間的延長而抑制率有所下降，但對其抑菌活性影響并不大，說明該菌株發(fā)酵液有較好的熱穩(wěn)定性。

2.2.3 菌株ZZ-9發(fā)酵液的可見光、紫外光穩(wěn)定性 由圖4可見，ZZ-9發(fā)酵液對可見光具有較好的穩(wěn)定性，在連續(xù)可見光照射8 h后，抑菌活性較對照沒有顯著差異。紫外照射較可見光照射，活性有所下降。在紫外光處理2 h后，發(fā)酵液活性仍然較高，可達94.38%，另外隨紫外照射時間的加長而發(fā)酵液活性也呈下降趨勢，但下降幅度不大。如紫外照射16 h 較紫外光照射8 h處理，其活性僅下降約1.5%左右，較對照也僅下降約3%，說明ZZ-9發(fā)酵液對可見光、紫外光都較好穩(wěn)定性。

圖3 溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of temperature on inhibitory activity of fermentation broth

圖4 光照對發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of illumination time on inhibitory activity of fermentation broth

2.2.4 菌株ZZ-9發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性 由圖5可見，發(fā)酵液在酸性環(huán)境中和在堿性環(huán)境中抑菌活性都較穩(wěn)定，其中在pH 2.0的較強酸性條件下，活性下降較為明顯，但仍然保持在94.15%；在pH 12.0的較強堿條件下，活性較對照差異不大，為96.14%，說明ZZ-9發(fā)酵液有較寬的酸堿適應范圍。然而經水浴加熱處理過的發(fā)酵液較未經水浴處理過的發(fā)酵液，其活性有所下降。如，pH 3.0 時，100 ℃水浴加熱處理60 min后，其抑制率下降約2%，而較對照下降約3%；pH 12.0時，100 ℃水浴加熱處理60 min后，抑制率下降僅1.5%?？傮w而言，發(fā)酵液不論在偏酸性的環(huán)境或偏堿性的環(huán)境下時，水浴加熱處理后發(fā)酵液活性略有降低，但變化不大，說明其活性穩(wěn)定性較好(表2)。

2.2.5 菌株ZZ-9發(fā)酵液貯藏穩(wěn)定性 由圖6可見，菌株ZZ-9發(fā)酵液在4 ℃和室溫(20～25 ℃)下貯藏30 d后，生物活性測定結果顯示抑菌活性幾乎沒變，其抑制率仍保持在96%以上，且各處理間差異無同統(tǒng)計學意義(P=0.05)。表明菌株ZZ-9產生的抑菌活性物質有很好的耐貯藏性，其貯藏時間至少1個月以上。

圖5 不同pH對發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of different pH on inhibitory activity of fermentation broth

表2 不同pH的發(fā)酵液在100 ℃水浴處理后抑菌率Table 2 Inhibition rate of different pH fermentation broth under the treatment of water bath by 100 ℃ %

圖6 貯藏時間對發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.6 Effect of storage time on inhibitory activity of fermentation broth

3 結論與討論

生物農藥因具有許多化學農藥不具備的優(yōu)點，符合發(fā)展綠色農業(yè)的要求而被不斷創(chuàng)新與利用，特別是微生物源農藥(也稱農用抗生素)由于高效、安全、與環(huán)境友好等特點而被廣泛開發(fā)與應用[7,17]。放線菌在自然界中分布最為廣泛，同時也是最早被用于植物病害防治的一類微生物[18]。據(jù)報道，目前至少有11 000多種生物活性物質來自于放線菌[19]，但放線菌產生的主要活性物質為大環(huán)內酯類抗生素，而大環(huán)內酯類抗生素在生產應用中很不穩(wěn)定[20-21]。邵彥坡等[22]從海洋分離到的一株放線菌B5經室內殺菌活性測定發(fā)現(xiàn)具有較廣譜的抗真菌與細菌活性，發(fā)酵液經80 ℃處理6 h，活性下降不到20%。在酸性條件下活性基本不變，但在堿性條件下活性極易喪失。

本研究通過菌絲生長速率法測定菌株ZZ-9的抑菌譜，試驗結果表明，菌株ZZ-9發(fā)酵液對15種植物病原真菌均具有不同程度的抑菌作用，抑菌譜較廣，尤其對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的抑制作用最為強烈，抑制率達98.75%。另外對荷蘭豆枯萎病菌(Fusariumoxysporum)和番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)的抑制率也達到60%以上。由于供試的植物病原真菌數(shù)量較少，故還不能確定其發(fā)酵液對未測試病原菌有無抑菌活性，且關于它的抑菌機制有待進一步研究。另外，本試驗只對病原真菌在室內條件下進行離體生測，而對其在大田試驗中防效是否理想也需進一步驗證。

本研究以蘋果樹腐爛病菌為靶標菌，對婁徹氏鏈霉菌ZZ-9發(fā)酵液穩(wěn)定性進行測定。結果表明，發(fā)酵液耐高溫、在強酸堿條件下較穩(wěn)定、可見光及紫外光處理后，生長抑制率無明顯下降，依然具有顯著抑菌活性，說明該菌產生的次生代謝產物有很好的穩(wěn)定性。張麗等[23]研究婁徹氏鏈霉菌YL-2代謝產物的穩(wěn)定性，其粗提物隨著溫度的升高，抑菌活性明顯下降，在弱酸性條件下抑菌活性比較穩(wěn)定，但對日光的穩(wěn)定性較差。這一結果與本研究的結果有所不同，這可能是因為菌株生長環(huán)境不同其發(fā)酵代謝產物活性、穩(wěn)定性也會不同。代鵬等[24]測定抗生素產生菌Streptomycesalbogriseus的傳代穩(wěn)定性，結果表明JFA-001菌株傳接6代時，活性穩(wěn)定，從第7代開始其活性緩慢降低，這一結果與本研究結果相似。綜上所述，該菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性良好，有望分離到新結構或新種類的抗生素，為該菌活性物質分離純化及產品的加工與應用提供一定的理論依據(jù)。

另外，放線菌產生的次生代謝產物種類繁多，性質各異，其活性、穩(wěn)定性等特征與其結構相關[25]。因此，對該菌株活性物質的種類、性質及結構有待深入研究。

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(責任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Antimicrobial Spectrum and Stability of Fermentation Broth Produced by Antagonistic Actinomycetes Strain ZZ-9

FAN Wanze,XUE Yingyu,ZHANG Shuwu,XU Bingliang

(College of Plant Protection，Gansu Agricultural University/Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province,Lanzhou 730070，China)

To study bacteriostatic spectrum of fermentation broth from actinomycetes strain ZZ-9 identified asStreptomycesrochei,and to verify the effect of it on stability of fermentation broth under biochemical and physical factors such as subculture,temperature,illumination,pH and ultraviolet conditions.As the tested phytopathogen,method of growth rate was used to determine antimicrobial spectrum of fermentation broth with 15 kinds of plant pathogenic fungus.WithCytosporasp.as indicator phytopathogen,the stability of fermentation broth under different conditions was measured .The bacteriostatic spectrum results showed that the fermentation broth of ZZ-9 strain had inhibitory effects at different degres on 15 kinds of pathogenic fungus.With growth inhibition rate of more than 96% and the lasting effect,the fermentation broth of ZZ-9 strain had the best effect onCytosporasp.andRhizoctoniasolani,and it had worse effect onBotryosphaeriapiricola,Cladosporiumcladosporioidesv andAscochytafabae,the inhibition rate was under 27%.The stability test showed that the activity of strain was stable until the 6th generation,it decreased significantly from the 7th generation,and the fermentation broth had high temperature resistance,good stability under strong acid and alkali,visible light and ultraviolet irradiation treatments.Moreover,the fermentation broth could be stored for at least 30 days at 4 ℃ and room temperature (20-25 ℃), the activity remained nearly unchanged.Therefore，the secondary metabolites of antagonistic actinomycetes ZZ-9 strain had broad-spectrum antibacterial activity and strong stability,and the potential could be developed into the microbial pesticide.

Antagonistic actinomycetes; Fermentation broth; Antimicrobial spectrum; Stability

FAN Wanze,male,master student.Research area: comprehensive management of plant diseases.E-mail fanwanze@foxmail,com

XUE Yingyu,male,associate professor,master supervisor.Research area: comprehensive management of plant diseases.E-mail:xueyy@gsau.edu.cn

SI詞頭

日期：2017-03-03

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0832.048.html

2016-02-02

2016-05-11

甘肅省農牧廳農業(yè)生物技術研究與應用開發(fā)項目(GNSW-2012-27)；國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0201112)。

范萬澤，男，碩士研究生，研究方向為植物病害綜合治理。E-mail:fanwanze@foxmail.com

薛應鈺，男，副教授，碩士生導師，研究方向為植物病害綜合治理。E-mail:xueyy@gsau.edu.cn

S482.2+92

A

1004-1389(2017)03-0463-08

Received 2016-02-02 Returned 2016-05-11

Foundation item Bio-tech Project of Department of Agriculture and Animal Husbandry of Gansu Province (No.GNSW-2012-27);The National Key Research and Development Plant Projects(2016YFD0201112).