李亞婕，張 樺，蔣圓圓，麻 浩，姚正培，任燕萍，王 澤，馬 林

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.哈密職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆哈密 839000； 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南京 210095；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 干旱區(qū)荒漠研究所，烏魯木齊 830052)

梭梭14-3-3蛋白基因 HaFT-1和 HaFT-2克隆及表達(dá)分析

李亞婕1，張 樺1，蔣圓圓2，麻 浩3，4，姚正培1，任燕萍1，王 澤4，馬 林1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.哈密職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆哈密 839000； 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南京 210095；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 干旱區(qū)荒漠研究所，烏魯木齊 830052)

根據(jù)前期梭梭干旱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的Unigene序列，成功克隆2個(gè)梭梭14-3-3蛋白基因，分別命名為 HaFT-1和 HaFT-2，并對(duì)其進(jìn)行基因表達(dá)分析。結(jié)果表明： HaFT-1基因在梭梭的根、種子中均可表達(dá)，且根中表達(dá)最強(qiáng)； HaFT-2基因在梭梭同化枝中表達(dá)最強(qiáng)，根的表達(dá)量次之。干旱脅迫后 HaFT-1和 HaFT-2基因的表達(dá)量均下調(diào)。本研究初步分析 HaFT-1、 HaFT-2基因的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究該基因功能奠定基礎(chǔ)。

梭梭；14-3-3蛋白；基因克?。槐磉_(dá)

梭梭(Haloxylonammodendron)為梭梭屬(Haloxylon Bunge)，藜科(Chenopodiaceae)超旱生小喬木，呈高大灌叢狀[1]。其主要生長(zhǎng)在中國(guó)的西北部，是重要的固沙植物，在沙地、固定和半固定沙丘，荒漠上廣泛分布[2]。梭梭也是中國(guó)荒漠半荒漠區(qū)固沙造林面積最大的建群樹種。具有耐旱、耐高溫、耐鹽堿、耐風(fēng)蝕等優(yōu)良品性[3]。在防沙固沙、減緩荒漠化、維護(hù)生態(tài)安全方面有著不可或缺的作用。

14-3-3蛋白是一類高度保守且功能多樣的調(diào)節(jié)蛋白，其在真核生物中普遍存在，分子量為28～33 ku[4]。該蛋白是由Moore等[5]1967年首次從牛腦組織中發(fā)現(xiàn)的一種酸性、可溶異源二聚體蛋白，根據(jù)該蛋白層析后分離組分的片段數(shù)和在淀粉凝膠電泳中的遷移率，命名為14-3-3蛋白。目前，已有20多種植物的14-3-3蛋白基因被克隆和鑒定，在番茄中已有12個(gè)14-3-3蛋白基因被發(fā)現(xiàn)，分別命名為 TFT1-TFT12[6]。余梅等[7]在茶樹中發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白基因，且該基因在花蕾發(fā)育晚期起到調(diào)控作用。趙秀玲等[8]通過RT-PCR技術(shù)，首次從菠菜中發(fā)現(xiàn)并克隆14-3-3蛋白基因，且命名為 So14-3-3，對(duì)該基因半定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸鹽處理后， So14-3-3基因在根和葉的表達(dá)增強(qiáng)。研究表明，14-3-3蛋白可調(diào)控基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的核定位和參與多種酶活性的調(diào)控，并且在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、脅迫應(yīng)答等多種細(xì)胞活動(dòng)中起到重要作用[9]。不同的14-3-3蛋白具有不同的組織特異性，調(diào)控植物的發(fā)育、應(yīng)答不同外界環(huán)境的刺激[10]。14-3-3蛋白參與的各種代謝調(diào)控、物質(zhì)運(yùn)輸和植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)等調(diào)控，是通過與其他蛋白相互作用而進(jìn)行的[11]。因此，研究14-3-3蛋白在植物中的功能和調(diào)控機(jī)理對(duì)理解植物響應(yīng)外界信號(hào)的分子機(jī)制十分重要。但有關(guān)梭梭14-3-3蛋白基因克隆和功能特征鮮見報(bào)道，本研究采用RT-PCR方法從梭梭的同化枝中提取并克隆14-3-3蛋白基因 HaFT-1和 HaFT-2，并且對(duì)這2個(gè)基因在梭梭的不同部位的表達(dá)以及在干旱脅迫下梭梭同化枝的表達(dá)進(jìn)行分析，為研究14-3-3蛋白在梭梭抗逆分子機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)材料 以新疆吐魯番荒漠植物園采集的梭梭種子為試驗(yàn)材料。種子用蒸餾水浸泡5 min用φ=75%酒精消毒30 s后轉(zhuǎn)入蒸餾水中沖洗3遍，待酒精洗凈后用次氯酸鈉溶液浸泡10 min，再用蒸餾水沖洗4遍，接種于MS培養(yǎng)基中待發(fā)芽后培養(yǎng)至3周左右，取其同化枝，提取RNA用于基因克隆。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒(Trizol法)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA marker、dNTPs、Buffer(Mg2+)、Taq酶分別購自Life Technologies Corporation、北京全式金生物技術(shù)有限公司、北京天根生化科技有限公司和TakaRa公司。氨芐青霉素(Amp+)和卡那霉素(Kan+)由植物分子生物學(xué)研究室提供。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 HaFT-1和 HaFT-2的克隆 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄操作方法參照Trizol說明書和First Srtand cDNA Synthesis kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒相關(guān)內(nèi)容。

根據(jù)前期梭梭干旱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果拼接得到的18個(gè)類似14-3-3蛋白基因相關(guān)序列，挑選2個(gè)拼接出全部讀碼框的Unigene，并進(jìn)行同源序列比對(duì)有較高相似性，推測(cè)可能屬于14-3-3蛋白。根據(jù)這2個(gè)序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物(見表1) HaFT-1基因引物為編號(hào)1和2， HaFT-2基因引物為編號(hào)3和4。以梭梭cDNA為模版，進(jìn)行PCR反應(yīng)。其反應(yīng)體系為Buffer(Mg2+) 2.5 μL、dNTPs 1.0 μL、上下游引物各1.0 μL、cDNA模板1.0 μL、Taq酶0.5 μL、最后加入ddH2O至總體積25 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 預(yù)擴(kuò)增5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物與Peasy-T1載體(全式金公司)連接，轉(zhuǎn)入DH5α中，驗(yàn)證其中陽性克隆，送上海生工測(cè)序。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.2.2 HaFT-1和 HaFT-2的序列分析 分別利用Protparam在線軟件、ProtScale的Hphob./Kyte &Doolittle算法、TMHMM Server v.2.0軟件及SOPMA在線軟件，對(duì) HaFT-1、 HaFT-2蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸組成、分子量等理化性質(zhì)，編碼的氨基酸序列疏水性/親水性，蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過NCBI網(wǎng)站Blast對(duì)氨基酸序列的同源性進(jìn)行搜索，并進(jìn)行同源序列比對(duì)， MEGA 4.0軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.3 HaFT-1和 HaFT-2在梭梭不同組織中的表達(dá)分析 取野生梭梭的根、同化枝、花和種子，每個(gè)組織取3個(gè)平行樣，于液氮中速凍，于-80 ℃保存。提取野生梭梭的根、同化枝、花和種子的RNA，反轉(zhuǎn)錄，以18S rRNA (GenBank登錄號(hào)：AJ577394)為內(nèi)參基因，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。 HaFT-1和 HaFT-2半定量RT-PCR反應(yīng)引物見表1中的5、6、7和8編號(hào)。其反應(yīng)體系為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 8 min，28個(gè)循環(huán)。

1.2.3 HaFT-1和 HaFT-2干旱脅迫后表達(dá)分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)采用熒光染料 SYBR Green I[Roche FastStart Univorsal SYBR Green Master(ROX)]，選取18S rRNA基因作為內(nèi)參基因，檢測(cè) HaFT-1和 HaFT-2這2個(gè)14-3-3蛋白基因在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。以正常生長(zhǎng)的1 a生梭梭同化枝(土壤含水量20%)作為對(duì)照，以土壤含水量在15%、12%、9%、6%及3%時(shí)的梭梭同化枝為干旱脅迫樣品，比較編碼 HaFT-1和 HaFT-2這2個(gè)14-3-3蛋白基因的表達(dá)差異。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的CT值，并采用Livak等的2-△△CT法[12]，對(duì) HaFT-1和 HaFT-2這2個(gè)14-3-3蛋白基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。 HaFT-1和 HaFT-2實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)引物見表1中的11、12、13和14編號(hào) 。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)45次。生成熔解曲線步驟為95 ℃ 0 s，20 ℃/s；65 ℃ 15 s，20 ℃/s；95 ℃ 0 s，0.1 ℃/s，40 ℃保存。每次試驗(yàn)的每個(gè)反應(yīng)樣品均設(shè)置3個(gè)技術(shù)性重復(fù)，按上述反應(yīng)程序在ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaFT-1和 HaFT-2基因的RT-PCR反應(yīng)及目的基因獲得

以梭梭cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到與目的片段大小相符的特異性條帶如圖1中1、2泳道所示，分別為 HaFT-1、 HaFT-2片段大小為856 bp和1 003 bp。送上海生工測(cè)序后，獲得 HaFT-1及 HaFT-2基因序列。GenBank登錄號(hào)分別是KU565486和KU565487。

2.2 梭梭 HaFT-1和 HaFT-2基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 序列特征分析 通過NCBI的ORF finder分析表明， HaFT-1和 HaFT-2 基因的ORF為795 bp和792 bp，編碼氨基酸個(gè)數(shù)分別為264和263，通過Blastp分析得知該基因編碼的蛋白質(zhì)均屬于14-3-3家族(如圖2)。

M.DL 2 000 Marker；1. HaFT-1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 HaFT-1 PCR amplification products；2. HaFT-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 HaFT-2 PCR amplification products

通過Protparam、ProtScale、TMHMM Server v.2.0軟件分別對(duì) HaFT-1和 HaFT-2基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白的分子量分別為29 985.5、29 762.3，等電點(diǎn)為4.79、4.84，分子式分別為C1310H2068N358O429S9、C1304H2067N353O426S8。不穩(wěn)定系數(shù)為41.89、51.43，均為不穩(wěn)定蛋白。應(yīng)用SignalP 3.0對(duì) HaFT-1和 HaFT-2基因編碼的蛋白序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。

2.2.2 梭梭 HaFT-1和 HaFT-2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 將 HaFT-1和 HaFT-2基因序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行在線分析和 BLAST 比對(duì)，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫其他物種 14-3-3蛋白基因的編碼區(qū)全序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，梭梭 HaFT-1與甜菜(Betavulgaris)有較高的同源性(92%)，其次與蠶豆(Viciafaba)的同源性達(dá)86%，與陸地棉(Gossypiumhirsutum)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、大戟屬(Euphorbia)的氨基酸的同源性分別達(dá)85%、84%、82%。 HaFT-2與冰菜(Mesembryanthemumcrystallinum)和甜菜(Betavulgaris)有較高的同源性，達(dá)92%。其次是木薯(Manihotesculentacrantz)，同源性達(dá)88%，與虎眼萬年青(Ornithogalumcaudatum)、大豆(Glycinemax)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)同源性分別達(dá)87%、84%、84%、83%。

A.基因 HaFT-1的保守結(jié)構(gòu)域 Conserved domains of HaFT-1 gene;B.基因 HaFT-2的保守結(jié)構(gòu)域 Conserved domains of HaFT-2 gene

采用DNAMAN軟件對(duì)甜菜(Betavulgaris)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、大戟屬(Euphorbia)、毛果楊(Populustrichocarpa)、木薯(Manihotesculentacrantz)、冰菜(Mesembryanthemumcrystallinum)、虎眼萬年青(Ornithogalumcaudatum)的14-3-3蛋白與梭梭的14-3-3蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)結(jié)果見圖3。 HaFT-1 和 HaFT-2基因氨基酸序列與其他物種14-3-3蛋白序列在5個(gè)區(qū)域高度保守(標(biāo)紅線區(qū)域)。除保守區(qū)域外，氨基末端和羧基末端有明顯差異，相似結(jié)構(gòu)證明14-3-3蛋白在功能上具有保守性，但是局部的差異結(jié)構(gòu)表明可能存在功能上的差異。

使用MEGA 5.0中鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹中物種及其登錄號(hào)見表2，由圖4可知，植物14-3-3蛋白共聚為兩大類，其中， HaFT-1與甜菜(XP_010689898)聚為一類，說明 HaFT-1與甜菜的親緣關(guān)系較近。 HaFT-2編碼的氨基酸序列與甜菜(XP_010692757)和冰菜(P93259)聚為一類。

2.3 HaFT-1和 HaFT-2組織特異性分析

用野生梭梭的根、同化枝、花和種子的cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR半定量。結(jié)果顯示， HaFT-1和 HaFT-2在不同組織中的表達(dá)水平不相同，其中 HaFT-1在根和種子中有明顯的表達(dá)，在根中表達(dá)量比種子的表達(dá)量高，而 HaFT-2在梭梭的根和同化枝中有明顯的表達(dá)，在同化枝中表達(dá)高于根的表達(dá)量。

2.4 梭梭 HaFT-1和 HaFT-2干旱脅迫后表達(dá)分析

以18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR分析 HaFT-1和 HaFT-2基因在PEG6000模擬干旱脅迫下的表達(dá)量，采用的是相對(duì)定量2- △△Ct法計(jì)算2個(gè)基因在鹽脅迫下的表達(dá)量(圖6)。結(jié)果顯示， HaFT-1在模擬干旱脅迫處理土壤含水量為12%時(shí)，表達(dá)量明顯升高。到處理后含水量為9%時(shí)，基因的表達(dá)量達(dá)到處理前的5.9倍， HaFT-1基因在處理后含水量6%恢復(fù)至處理前的水平，在含水量為3%時(shí)恢復(fù)至處理前的1.5倍。 HaFT-2在處理后含水量為12%時(shí)，表達(dá)量達(dá)到處理前的1.5倍，之后略有下降，并達(dá)到處理前表達(dá)量水平。說明 HaFT-1基因受到干旱脅迫誘導(dǎo)。 HaFT-2在模擬干旱脅迫前后基本沒有變化，因而 HaFT-2與抗旱性關(guān)系不明顯。

圖3 HaFT-1和 HaFT-2氨基酸序列比對(duì)Fig.3 HaFT-1 and HaFT-2 amino acid sequence alignments

表2 相關(guān)物種 14-3-3蛋白基因及其登錄號(hào)Table 2 14-3-3 gene related species and their GenBank accession numbers

圖4 不同植物14-3-3蛋白( HaFT-1和 HaFT-2)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogentic tree of 14-3-3 ( HaFT-1， HaFT-2) sequence based on different plant species

A.梭梭的根 Roots of Haloxylon ammodendron；B.梭梭的同化枝 Assimilation sticks of Haloxylon ammodendron；C.梭梭的種子 Seeds of Haloxylon ammodendron；D.梭梭的花 Flowers of Haloxylon ammodendron

3 討論與結(jié)論

14-3-3蛋白具有組織特異性，在調(diào)控植物的發(fā)育表達(dá)和應(yīng)答外界環(huán)境刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于中心地位[10]，在逆境生理反應(yīng)中起到重要作用[5]。目前，擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有13個(gè)成員[13]、煙草(Nicotianatabacum)中有11個(gè)成員[14]、大豆(Glycinemax)中有16個(gè)成員[15]、水稻(Oryzasativa)中有8個(gè)成員被成功鑒定[16]。本研究以梭梭為研究材料，通過RT-PCR方法從中克隆出2個(gè)與逆境相關(guān)的14-3-3蛋白基因，分別命名為 HaFT-1和 HaFT-2，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。這2個(gè)14-3-3蛋白基因ORF大小為795 bp和792 bp，編碼的氨基酸個(gè)數(shù)分別為264和263。同時(shí)，分別對(duì)基因 HaFT-1和 HaFT-2編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個(gè)蛋白的理化性質(zhì)相似，二級(jí)結(jié)構(gòu)均是α螺旋所占比例最大，并且都是親水性、不穩(wěn)定蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)。氨基酸序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)14-3-3蛋白均與甜菜同源性最高，均為92%。各個(gè)物種的14-3-3蛋白在保守區(qū)域外，氨基酸序列差異相對(duì)較大。分子進(jìn)化樹顯示， HaFT-1與甜菜聚為一枝； HaFT-2與甜菜、冰菜聚為一枝，二者親緣關(guān)系最近。

圖6 梭梭14-3-3蛋白基因在干旱脅迫下的表達(dá)Fig.6 Expression patterns of Haloxylon ammodendron 14-3-3 protein gene under condition of drought stress

對(duì)14-3-3蛋白相關(guān)特異性表達(dá)研究表明，茶樹14-3-3蛋白基因在其他組織不表達(dá)，僅在晚期花蕾中特異性表達(dá)[7]。甘蔗14-3-3蛋白基因有較高并且較豐富的表達(dá)信號(hào)在其根、莖、葉中，其中葉具有最少含量，莖具有顯著上調(diào)的表達(dá)活性[4]。研究短柄草14-3-3基因家族表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，短柄草的7個(gè)14-3-3蛋白基因在根、莖、未成熟葉、成熟葉和葉鞘等組織中均有表達(dá)，暗示這7個(gè)14-3-3蛋白基因可能是組成型表達(dá)基因[17]。本研究明確14-3-3蛋白基因在梭梭根、同化枝、花和種子中的表達(dá)均不相同，其中基因 HaFT-1在根及種子中表達(dá)，在根中表達(dá)量比種子的表達(dá)量高，基因 HaFT-2在同化枝和根中表達(dá)明顯，在同化枝中表達(dá)高于根的表達(dá)量。綜合2個(gè)14-3-3蛋白基因在不同組織中的表達(dá)情況，可以看出，2個(gè)基因在花中的表達(dá)量均不明顯。梭梭14-3-3蛋白基因在不同組織中的表達(dá)說明其與不同組織的功能有密切關(guān)系，且表達(dá)具有特異性。

研究杉木14-3-3蛋白基因發(fā)現(xiàn)，杉木14-3-3蛋白基因可能參與杉木應(yīng)答干旱逆境反應(yīng)[18]。部分研究者通過研究14-3-3蛋白與質(zhì)膜H+-ATP酶的互作來探討14-3-3蛋白應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)理[19-20]。梭梭是旱生植物中的典型代表，為深入研究梭梭14-3-3蛋白抵御干旱逆境的機(jī)理，利用熒光定量qRT-PCR方法探究 HaFT-1和 HaFT-2在干旱脅迫下的表達(dá)情況。在干旱脅迫下， HaFT-1和 HaFT-2表達(dá)量均有所上升，但變化趨勢(shì)卻有著明顯的不同。 HaFT-1在模擬干旱脅迫處理土壤含水量為12%時(shí)，表達(dá)量明顯升高，到處理后含水量為9%時(shí)，基因的表達(dá)量達(dá)到處理前的5.9倍， HaFT-1基因在處理后含水量6%恢復(fù)至處理前的水平，在含水量為3%時(shí)恢復(fù)至處理前的1.5倍。 HaFT-2在處理后含水量為12%時(shí)，表達(dá)量達(dá)到處理前的1.5倍，之后略有下降，并達(dá)到處理前表達(dá)量水平。說明 HaFT-1基因受到干旱脅迫誘導(dǎo)。 HaFT-2在模擬干旱脅迫前后基本沒有變化，因而 HaFT-2與抗旱性關(guān)系不明顯。這表示 HaFT-1和 HaFT-2 這2個(gè)基因?qū)?yīng)答干旱脅迫表現(xiàn)出不同的調(diào)控機(jī)制。目前，對(duì)于梭梭14-3-3蛋白的遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不清楚，有待于以后進(jìn)一步深入研究。

Reference：

[1] 王成云.梭梭屬植物對(duì)大氣干旱的季節(jié)性生理生化響應(yīng)[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

WANG CH Y,Seasonal physiological and biochemical response ofHaloxylonBunge to atmosphere drought[D].Urumqi: Xinjiang Agricultural University,2006(in Chinese with English abstract).

[2] 郭泉水,郭志華,閻 洪,等.我國(guó)以梭梭屬植物為優(yōu)勢(shì)的潛在荒漠植被分布[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2005,25(4):848-853.

GUO Q SH,GUO ZH H,YAN H,etal.Study on potential distribution ofHaloxylonplants dominated desert vegetation in China[J].ActaEcologicaSinica,2005,25(4):848-853(in Chinese with English abstract).

[3] 董占元,姚云峰,趙金仁,等.梭梭光合枝細(xì)胞組織學(xué)觀察及其抗逆性特征[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境,2000,14(5):78-83.

DONG ZH Y,YAO Y F,ZHAO J R,etal.Anatomical observations on the plotosynthatic branch ofHaloxylonammodendrom(C.A.Mey) Bunge and it is the character of drought and salt resistance[J].JournalofAridLandResourcesandEnvironment,2000,14(5):78-83(in Chinese with English abstract).

[4] 羅煉芳,孔 冉,蘇俊波.甘蔗14-3-3基因克隆及表達(dá)分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,44(11):1757-1764.

LUO L F,KONG R,SU J B.Cloning and expression analysis of 14-3-3 gene fromSaccharumspp.Hybrids[J].JournalofSouthernAgriculture,2013,44(11):1757-1764(in Chinese with English abstract).

[5] MOORE B W,PEREZ V J.Specific acidic proteins of the nervous system[J].InPhysiologicalandBiochemicalAspectsofNervousIntegration,1967:343-359.

[6] XU W,SHI W.Expression profiling of the 14-3-3 gene family in response to salt stress and potassium and iron deficiencies in young tomato (Solanumlycopersicum) roots:analysis by real-time RT-PCR[J].AnnalsofBotany,2006,98(5):965-974.

[7] 余 梅,江昌俊,房婉萍,等.茶樹花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差異表達(dá)分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(10):2983-2991.

YU M,JIANG CH J,FANG W P,etal.Cloning and analysis of differential expression of a 14-3-3 protein gene from tea flower bud[J].ScientiaAgriculturaSinica,2008,41(10):2983-2991(in Chinese with English abstract).

[8] 趙秀玲,徐慧妮,郭傳龍,等.菠菜14-3-3蛋白基因的克隆及硝酸鹽脅迫下的表達(dá)分析[J].西北植物學(xué)報(bào),2013,33(3):450-457.

ZHAO X L,XU H N,GUO CH L,etal.Cloning and expression analysis of 14-3-3 protein gene ofSpinachunder nitrate stress[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2013,33(3):450-457(in Chinese with English abstract).

[9] 周 穎,李冰櫻,李學(xué)寶.14-3-3蛋白對(duì)植物發(fā)育的調(diào)節(jié)作用[J].植物學(xué)報(bào),2012,47(1):55-64.

ZHOU Y,LI B Y,LI X B.Roles of 14-3-3 proteins in regulating plant development[J].ChineseBulletinofBotany,2012,47(1):55-64(in Chinese with English abstract).

[10] OKSVOLD M P,HUITFELDT H S,LANGDON W Y.Identification of 14-3-3 zeta as an EGF receptor interacting protein[J].FebsLetters,2004,569 (1-3):207-210.

[11] 崔 娜,于志海,韓明利,等.植物14-3-3蛋白研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2012,32 (4):843-845.

CUI N,YU ZH H,HAN M L,etal.Research advancement of 14-3-3 proteins in plant[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2012,32(4):843-845(in Chinese with English abstract).

[12] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T)) method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[13] ROSENQUIST M,ALSTERFJORD M,LARSSON C,etal.Data mining theArabidopsisgenome reveals fifteen 14-3-3 genes.Expression is demonstrated for two out of five novel genes[J].PlantPhysiology,2001,127(1):142-149.

[14] COTELLE V,MEEK S E,PROVAN F,etal.14-3-3s regulate global cleavage of their diverse binding partners in sugar-starvedArabidopsiscells[J].EmboJournal,2001,19(12):2869-2876.

[15] LI X,DHAUBHADEL S.Soybean 14-3-3 gene family:identification and molecular characterization[J].Planta,2010,233(3):569-582.

[16] WANG C,MA Q H,LIN Z B,etal.Cloning and characterization of a cDNA encoding 14-3-3 protein with leaf and stem-specific expression from wheat[J].DnaSequencetheJournalofDnaSequencing&Mapping,2008,19(2):130-136.

[17] 唐振鑫,楊海靈.短柄草14-3-3基因家族的生物信息學(xué)及表達(dá)模式研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(7):139-142.

TANG ZH X,YANG H L.Bioinformatic and expression pattern analysis ofBrachypodium14-3-3 gene family[J].GuangdongAgriculturalSciences,2013(7):139-142(in Chinese with English abstract).

[18] 倪點(diǎn)樂.杉木14-3-3蛋白基因的克隆和表達(dá)分析[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2013.

NI D L.Cloing and expression analysis of 14-3-3 protein genes inCunninghamialanceolate(Lamb.) Hook[D].Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University,2013(in Chinese with English abstract).

[19] 周 冰.蠶豆14-3-3蛋白與質(zhì)膜H+-ATP酶應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)理研究[D].昆明:昆明理工大學(xué),2013.

ZHOU B.Molecular mechanisms of response to drought stress for broad bean 14-3-3 proteins and plasma membrane H+-ATPase[D].Kunming: Kunming University of Science and Technology,2013(in Chinese with English abstract).

[20] 李 松.玉米14-3-3蛋白和質(zhì)膜H+-ATP酶應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)制研究[D].昆明:昆明理工大學(xué),2013.

LI S.Molecular mechanisms of 14-3-3 proteins and plasma membrane H+-ATPase enzyme of maize response to drought stress[D].Kunming: Kunming University of Science and Technology,2013(in Chinese with English abstract).

(責(zé)任編輯：史亞歌 Responsible editor:SHI Yage)

Cloning and Expression Analysis of HaFT-1 and HaFT-2 Genes inHaloxylonammodendron

LI Yajie1,ZHANG Hua1,JIANG Yuanyuan2,MA Hao3,4,YAO Zhengpei1,REN Yanping1,WANG Ze4and MA Lin1

(1.College of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.Hami Vocational Technical College,Hami Xinjiang 839000,China; 3.College of Agronomy,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China; 4.Desert Institute in Drought Areas,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China )

Based on Unigene sequences fromHaloxylonammodendronarid transcriptome database,twoHaloxylonammodendrongenes HaFT-1 and HaFT-2 of 14-3-3 protein were successfully cloned,and it was analyzed and gene was expressed.The results showed that the HaFT-1 gene expression was both in roots and seeds ofHaloxylonammodendron,and showed the strongest expression in root;the HaFT-2 gene showed the highest expression in assimilation sticks ofH.ammodendron,and then in the roots.After drought stress,HaloxylonHaFT-1 and HaFT-2 gene expressions were adjusted downward.This study preliminarily analyzed the expression pattern of HaFT-2 and HaFT-1 gene,and laid foundation for further research on function of this gene.

Haloxylonammodendron；14-3-3 protein；Gene clone；Expression

LI Yajie,female,master student.Research area:resistance of plant breeding.E-mail:631680263@qq.com

MA Lin,male,professor.Research area:agriculture in arid areas and conservation tillage.E-mail: malin5738@126.com

日期：2017-03-03

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0833.050.html

2016-03-02

2016-03-31

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260181)。

李亞婕，女，碩士生，研究方向?yàn)榭鼓嬷参镉N學(xué)。E-mail：631680263@qq.com

馬 林，男，教授，研究方向?yàn)楦珊祬^(qū)農(nóng)業(yè)和保護(hù)性耕作。E-mail:malin5738@126.com

Q943.2

A

1004-1389(2017)03-0455-08

Received 2016-03-02 Returned 2016-03-31

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.31260181).