劉永宏，李 飛，張路瑤，趙 麗

(塔里木大學 動物科學學院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

新疆南疆驢源H3N8亞型EIVHA基因序列分析

劉永宏，李 飛，張路瑤，趙 麗

(塔里木大學 動物科學學院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

為明確新疆南疆驢是否感染馬流感病毒(Equine influenza virus,EIV)及驢源EIVHA基因特征，根據(jù)GenBank登錄的EIV基因序列，設(shè)計合成1 對引物，采集新疆南疆地區(qū)2 個驢屠宰點33 份驢肺組織樣品，采用RT-PCR擴增驢源EIVHA基因片段，并對擴增產(chǎn)物進行測序與序列分析。結(jié)果表明，中國新疆南疆驢源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株HA基因長1 704 bp，編碼567 個氨基酸。同源性分析結(jié)果顯示，與國內(nèi)外H3N8亞型EIV參考毒株核苷酸和氨基酸同源性分別為88.9%～99.9%和88.3%～99.8%，與國內(nèi)毒株和哈薩克斯坦毒株在一個進化分支內(nèi)。與GenBank數(shù)據(jù)庫中唯一1 個驢源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的比對結(jié)果顯示，2 個毒株裂解位點、糖基化位點、抗原位點和受體結(jié)合位點氨基酸完全一致，只是錯位2 個氨基酸。確定新疆南疆存在驢感染EIV，可能為國內(nèi)疫情的延續(xù)或周邊國家傳入。

新疆南疆；驢；馬流感病毒；H3N8亞型

馬流行性感冒，簡稱馬流感(Equine influenza,EI)，是由馬流感病毒(Equine influenza virus,EIV)引起馬、驢和騾的一種高度接觸性呼吸道傳染病[1-2]，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)該病毒還感染犬和豬[3-4]。世界動物衛(wèi)生組織將其列為法定報告動物傳染病，中國將其列為三類動物疫病[5]。馬流感病毒屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒屬(Influenza virus A)。目前，A型流感病毒根據(jù)血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)抗原不同可以分為不同的亞型，H1～H16 16 個亞型和N1～N9 9 個亞型。從系統(tǒng)發(fā)育生物學角度分別對HA基因和NA基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進行分析，所獲結(jié)果也為上述分類提供佐證[6]。EIV有 2 個亞型，分別是H7N7亞型EIV(馬甲1型)和H3N8亞型EIV(馬甲2型)[1，7-8]。馬流感的頻繁暴發(fā)對養(yǎng)馬業(yè)尤其賽馬業(yè)危害極其嚴重，已在世界范圍內(nèi)造成巨大的經(jīng)濟損失。

中國歷史上至少發(fā)生過 4 次馬流感大流行，即1974 年由H7N7亞型EIV引起的首次大流行，疫情首先從新疆開始，然后向南向東傳播蔓延至 17 個省(市)、自治區(qū)，自此之后H7N7亞型EIV在中國馬群中再未分離到；1989-1990 年，在吉林、黑龍江和內(nèi)蒙古連續(xù) 2 次暴發(fā)馬流感疫情；1992-1994 年，在中國西部、西北、華北和西南等地區(qū)馬群中暴發(fā)馬流感疫情；2007年，新疆、甘肅省相繼暴發(fā)馬流感疫情，并迅速蔓延傳播到華北地區(qū)。后3 次馬流感疫情均由H3N8亞型EIV引起[9]。

目前，新疆及新疆周邊鄰國存在馬流感疫情[10-12]，這對新疆地區(qū)馬屬動物的威脅十分嚴重。此外，考慮新疆南疆特殊的氣候環(huán)境和地域地貌特點，有必要研究這個曾經(jīng)的疫區(qū)當前是否存在EIV以及EIV毒株的特征。本研究對采集自新疆南疆的驢肺組織樣品進行EIV核酸檢測，并對HA基因進行序列分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 組織樣品 33 份驢肺組織樣品，2015年采自新疆南疆地區(qū)2 個驢屠宰點，-20 ℃保存，備用。

1.1.2 主要試劑 Trizol invitrogenTM(Code No.15596-026)，購自Invitrogen生物工程有限公司；RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(Code No.RR019A)，PremixTaq○RVersion2.0(Code No.R004A)，DL2000 DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司；TIANgel Midi Purification Kit(Code No.DP209)，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 利用Primer Premier 5.0，以GenBank數(shù)據(jù)庫中國內(nèi)外已發(fā)表的保守的馬屬動物H3N8亞型EIV和H7N7亞型EIV的HA基因全序列為參照設(shè)計1 對特異性引物。上游引物HA1為5′-AGCAAAAGCAGGGGATATT-3′，下游引物HA2為5′-AGTAG- AAACAAGGGTGTTTT-3′，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，預期擴增產(chǎn)物大小約為1.8 kb。

1.1.4 參考毒株 國內(nèi)外不同地區(qū)不同時間的53 個EIVHA基因全序列，均來源于GenBank數(shù)據(jù)庫，毒株詳細信息見表1。

表1 參考毒株Table 1 Reference isolates

(續(xù)表1 Continued table 1)

1.1.5 主要儀器 PCR儀(TC-5000,Bibby scientific Ltd)，小型高速冷凍離心機(R134a,Hermetically sealed refigeration system)，電泳儀(DYY-12，北京市六一儀器廠)，紫外分析儀(JY02S,北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取 按Trizol invitrogenTM試劑盒操作說明從驢肺組織樣品中提取總RNA。

1.2.2 RT-PCR反應(yīng) 以提取的總RNA為模板，利用RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒和合成的HA基因特異性引物，采用一步法擴增HA基因片段，退火溫度為53 ℃。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化回收 RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，按照TIANgel Midi Purification Kit試劑盒說明進行目的片段回收純化。

1.2.4 測序 將純化的目的片段標記后送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.5 序列分析 測序結(jié)果與表1中不同地區(qū)不同時間來源的53 個EIVHA基因全序列用DNAStar軟件EditSeq程序?qū)⑵浜塑账岷桶被嵝蛄蟹謩e保存為*.Seq和*.Pro格式文件，應(yīng)用該軟件MegAlign程序Clustal W法進行比對，然后在Veiw菜單中Sequence Distance和Phylogenetic Tree提取序列比對結(jié)果和進化樹圖。同時結(jié)合毒株時空分布分析中國新疆南疆地區(qū)驢源EIV來源及演變特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 驢源EIVHA基因片段RT-PCR擴增

RT-PCR擴增結(jié)果顯示，33 份樣品中有2 份樣品為陽性，目的片段大小約1.8 kb，與預期一致，陰性對照成立(圖1)。

M.Maker；1.陰性對照 Negative control；2～3.HA基因 HA gene

2.2 中國新疆南疆驢源EIVHA基因核苷酸序列分析

對擴增的HA基因片段測序，并將測序結(jié)果與GenBank中部分EIVHA基因序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國新疆南疆驢源EIV為H3N8亞型，命名為A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)，其HA基因包括1 個完整閱讀框，長1 704 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫中唯一1 個驢源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)HA基因的核苷酸同源性為99.6%；與2007年中國廣西EIV毒株A/equine/Guangxi/1/2008(H3N8)HA基因的核苷酸同源性最高，為99.7%；與1994年中國青海EIV毒株A/equine/Qinghai/1/1994(H3N8)HA基因的核苷酸同源性最低，為95.1%；與國外的毒株相比，核苷酸同源性最高的為2007年來源于哈薩克斯坦的毒株A/equine/Otar/764/2007(H3N8)，同源性達99.9%；最低的為來源于阿爾及利亞的毒株A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)，同源性僅88.9%。與H7N7亞型EIV毒株核苷酸同源性變幅為58.2%～58.9%。

根據(jù)HA基因核苷酸序列繪制的進化樹顯示(圖2)，囊括來源于28 個國家的54 個EIV毒株被劃分為2個大的分支，1個分支為H3N8亞型EIV毒株，另1個分支為H7N7亞型EIV毒株，A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)被劃分在H3N8亞型分支，該毒株與2007年新疆的1 個馬源毒株A/equine/Xinjiang/1/2007(H3N8)和1 個驢源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)，以及2009年1 個來源于印度的毒株A/equine/Ahmedabad/1/2009(H3N8)在1 個小的進化分支內(nèi)；其次，與2008年中國廣西的A/equine/Guangxi/1/2008(H3N8)株、2007年哈薩克斯坦的A/equine/Otar/764/2007(H3N8)株和2010年中國黑龍江的A/equine/Heilongjiang/1/2010(H3N8)株進化關(guān)系也非常近。

2.3 中國新疆南疆驢源EIVHA基因編碼氨基酸序列分析

中國新疆南疆驢源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的HA基因編碼567 個氨基酸，與A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的HA氨基酸同源性為 98.2%；與國內(nèi)毒株氨基酸同源性最高的為2010年中國黑龍江的A/equine/Heilongjiang/1/2010(H3N8)株，同源性為99.1%；與中國毒株氨基酸同源性最低的為1994年中國青海的A/equine/Qinghai/1/1994(H3N8)株，同源性僅94.2%。與國外毒株相比，氨基酸同源性最高的為2007年哈薩克斯坦的A/equine/Otar/764/2007(H3N8)株，同源性達99.8%；與H3N8亞型EIV毒株氨基酸同源性最低的為日本的A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8)株，同源性為88.3%。與H7N7亞型EIV毒株氨基酸同源性變幅為45.3%～46.2%。

2.3.1 HA裂解位點處序列分析 中國新疆南疆驢源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的HA裂解位點處(HA1與HA2之間連接肽)的序列為-PEKQIRG↓IF-，與A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的一致。其他毒株為-PE/G(A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8))K(H3N8)/R(H7N7)R(A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8)和A/equine/Algiers/1/1972(H3N8))/Q(其余H3N8)/K(H7N7)/L(A/equine/Sao Paulo/1/1969(H3N8)、A/equine/Algiers/1/1972(H3N8)和A/equine/Tokyo/2/1971(H3N8))/I(其余H3N8)K(H7N7)RG↓I(H3N8)/L(H7N7)F-。H7N7亞型EIV在-PE│KQ-處插入(│插入位點)11 個氨基酸。

2.3.2 HA糖基化位點分析 中國新疆南疆驢源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的HA氨基酸序列含有8 個糖基化位點，分別位于N25NT、N39GT、N55AT、N70NS、N80CT、N182VT、N302GS和N500GT位，與毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)糖基化位點分布個數(shù)相同，但錯位2 個氨基酸。

2.3.3 HA抗原位點分析 中國新疆南疆驢源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)的HA上有A、B、C、D和E 5 個抗原位點，位點A由140～146 位的EGFTWTG氨基酸殘基和133～137 位GTLEF氨基酸殘基組成，位點B由156～160 位CKRGS氨基酸殘基和187～198 位NNKNFDKLYIWG氨基酸殘基組成；位點C為V53、T54、F275和K278位氨基酸殘基組成；位點D由E207和L171位氨基酸殘基組成；位點E為I63、G78、C81和L83位氨基酸殘基組成。與毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)抗原位點氨基酸完全一致，只是錯位2 個氨基酸。

2.3.4 HA受體結(jié)合位點(RBS)分析 中國新疆南疆驢源EIV毒株A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)HA的受體結(jié)合位點為Y98、E136、F137、T143、S153、A155、V183、P186、N190、K193、L194、Y195、I196、W197、S216、S226、Q227和Q228，與毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)受體結(jié)合位點處氨基酸一致，也錯位2 個氨基酸。

圖2 馬流感病毒毒株HA基因系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HA gene of EIV isolated

3 討 論

通過對新疆南疆驢肺組織樣品進行EIV核酸檢測及HA序列分析，證實目前中國新疆南疆驢體內(nèi)存在H3N8亞型EIV。A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)與中國新疆2007年驢源毒株核苷酸同源性為99.6%；與中國EIV毒株核苷酸同源性最高的為2007年中國廣西的A/equine/Guangxi/1/2008(H3N8)株，達99.7%；與國外毒株核苷酸同源性最高的為2007年哈薩克斯坦的A/equine/Otar/764/2007(H3N8)株，同源性達99.9%。HA基因核苷酸全序列基因進化樹也顯示，本研究毒株與2007年新疆1 個馬源毒株和1 個驢源毒株，以及2009年1 個印度毒株在一個小的進化分支內(nèi)。其次，與2008年中國廣西株、2007年哈薩克斯坦株和2010年中國黑龍江株關(guān)系也非常近。表明新疆南疆驢源毒株可能為早些時間中國EIV毒株的延續(xù)或周邊國家毒株跨境或季風原因傳播擴散的。

HA是一種糖蛋白，是宿主免疫系統(tǒng)的主要靶抗原，可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體，發(fā)揮免疫保護作用，抵抗流感病毒的感染。HA蛋白的抗原位點易發(fā)生變異，并可引起HA抗原漂移。EIV HA主要功能是結(jié)合宿主的唾液酸受體，使病毒附著于細胞上，進而穿過宿主細胞膜并改變抗原性及逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視等。病毒與宿主細胞有效的結(jié)合對于在流行和暴發(fā)期間病毒擴散是至關(guān)重要的。病毒與宿主細胞受體結(jié)合以及病毒與細胞膜的融合都是由HA介導的。因此，HA是病毒毒力和宿主范圍的一個重要決定因素[9]。A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株HA的裂解位點處不具有4 個或4 個以上連續(xù)的與病毒致病力有關(guān)的堿性氨基酸聚集，說明本研究的毒株為低致病性流感病毒。該毒株HA的糖基化位點有6 個，與A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)相比，糖基化位點總數(shù)相同，但由于第8位氨基酸后有2 個氨基酸(FI)插入，所以導致本研究的毒株所有糖基化位點位置后移2 位氨基酸?？乖稽c和受體結(jié)合位點也是同A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)沒有任何變化，只是后移2 位氨基酸。

H3N8亞型EIV屬于A型流感病毒，可感染多種哺乳動物，并在宿主間廣泛傳播[13-15]，據(jù)報道，H3N8亞型EIV能從馬跨越種間障礙傳播給狗和豬[3-4]，該特征給流感防制造成一定程度的困難。新疆及新疆周邊國家存在馬流感疫情，且隨著新絲綢之路及國家政策對新疆馬業(yè)發(fā)展的影響，新疆馬匹的流動性日益增強、流動范圍越來越廣，為馬流感的傳播提供有利條件。希望馬業(yè)相關(guān)單位重視對馬屬動物馬流感疫情及哺乳動物馬流感的監(jiān)測，為馬業(yè)的健康長期發(fā)展提供保障。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Sequence Analysis ofHAGene of H3N8 EIV of Donkey in South Xinjiang

LIU Yonghong,LI Fei,ZHANG Luyao and ZHAO Li

(Key Laboratory of Tarim Animanl Husbandry Science and Technology of Xinjiang Production & Construction Corps,College of Animal Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China)

In order to clarify whether donkey was infected by EIV in South Xinjiang and the characteristics of HA gene of EIV from donkey,a pair of primers was designed and synthesized according to the sequence of HA gene from GenBank.The HA gene fragment was amplified by RT-PCR for 33 samples of donkey lungs from two donkey slaughter houses in South Xinjiang.Then the electrophoresis analysis, gel recovery,sequencing and sequence analysis were utilized.The results showed that HA gene of A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8) strain was 1 704 bp in length,encoding 567 amino acids.The homology of the nucleotide sequence and the amino acid sequence with H3N8 subtype of EIV reference strains from domestic and foreign was 88.9%-99.9% and 88.3%-99.8%,respectively.The strain,the Chinese strains and Kazakhstan strain were in same evolutionary branching.Amino acids of cleavage site,glycosylation site,glycosylation site and receptor binding site were completely consistent with A/donkey/Xinjiang/5/2007 (H3N8) that the only one strain from donkey in the GenBank database,but two amino acids were misplaced.There were donkeys infected with EIV in South Xinjiang and what may be continuation of the domestic epidemic or introduced from the neighboring countries.

South Xinjiang; Donkey; EIV; H3N8 subtype

LIU Yonghong,male,associate professor.Research area: infectious diseases and immune pathology.E-mail: lyhdky@126.com

ZHAO Li,female,Ph.D,associate professor.Research area: parasitic diseases and immune pathology.E-mail:zhaolidky@126.com

日期：2017-03-03

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0836.078.html

2016-02-05

2016-03-24

兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題(HS2014011)。

劉永宏，男，副教授，研究方向為傳染病與免疫病理學。E-mail: lyhdky@126.com

趙 麗，女，博士，副教授，研究方向為寄生蟲病與免疫病理學。E-mail: zhaolidky@126.com

S855.3

A

1004-1389(2017)03-0329-07

Received 2016-02-05 Returned 2016-03-24

Foundation item Key Laboratory of Tarim Animanl Husbandry Science and Technology (No.HS2014011).