杜馨娥，周云，陳英杰，施敏，鐘文遠(yuǎn)，周軼平*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，昆明650500；2.云南開放大學(xué)化學(xué)學(xué)院，昆明650223；3.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明650500；4.昆明學(xué)院化學(xué)系，昆明650214）

鐵-氟尿嘧啶配合物抗腫瘤活性研究

杜馨娥1，周云2，陳英杰3，施敏1，鐘文遠(yuǎn)4，周軼平1*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，昆明650500；2.云南開放大學(xué)化學(xué)學(xué)院，昆明650223；3.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明650500；4.昆明學(xué)院化學(xué)系，昆明650214）

目的：探討鐵-氟尿嘧啶配合物的抗腫瘤活性和對人胃癌細(xì)胞凋亡的影響。方法：采用MTT法檢測配合物及其配體對K562、HCT-116、SGC-7901、MCF-7和HEPG-2細(xì)胞的增殖抑制作用；Hoechst 33342/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測對人胃癌細(xì)胞凋亡的影響；RT-qPCR檢測對Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響。結(jié)果：配合物作用5株細(xì)胞后的IC50值分別為7.8×10-5、5.4×10-5、3.5×10-5、1.1×10-4和2.2×10-5mol/L，能明顯抑制細(xì)胞的增殖。配合物以10-5mol/L濃度作用SGC-7901細(xì)胞36 h后，凋亡率為9.8%，能明顯促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡（P＜0.01），作用強(qiáng)于其配體5-Fu和Phen（P＜0.01）；使凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達(dá)上調(diào)至4.9（P＜0.01）；Bcl-2表達(dá)下調(diào)至0.2（P＜0.01）。結(jié)論：鐵-氟尿嘧啶配合物具有良好的體外抗腫瘤活性，其發(fā)揮抗腫瘤作用可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，而其誘導(dǎo)凋亡的作用可能與Caspase-3基因上調(diào)和Bcl-2基因下調(diào)有關(guān)。

鐵-氟尿嘧啶配合物；細(xì)胞毒活性；凋亡

20世紀(jì)60年代，Rosenberg發(fā)現(xiàn)鉑類化合物能抑制腫瘤細(xì)胞生長，金屬鉑配合物順鉑抗腫瘤作用的發(fā)現(xiàn)及臨床應(yīng)用，開辟了金屬配合物抗腫瘤藥物研究的新領(lǐng)域，對金屬配合物的研究逐步擴(kuò)展〔1-2〕。國內(nèi)外在該領(lǐng)域的研究十分活躍，合成出多種新型鉑、釕、金、銀、銅、稀土、席夫鄰菲羅啉（Phenanthroline，Phen）堿金屬配合物等，都具有抗腫瘤活性〔3〕。

本文擬通過合成以目前臨床抗腫瘤藥物分子作為配體的新型配合物，得到具有協(xié)同作用的抗腫瘤藥物。氟尿嘧啶（fluorouracil，5-Fu）及Phen作為配體與金屬鐵離子結(jié)合形成配合物，既有可能產(chǎn)生多種物質(zhì)抗腫瘤的協(xié)同作用，增強(qiáng)其抗腫瘤作用，同時又有降低毒性的可能性。鐵作為大量酶和生理過程中的一種必需輔助因子，可能比非必需金屬（如鉑）的毒性更小。機(jī)體內(nèi)鐵含量減少，可減弱抗體免疫功能，降低機(jī)體抗感染和防癌的能力〔4〕。鐵離子具有較強(qiáng)的配位能力，能與多種類型的天然產(chǎn)物形成配合物，且生成的配合物大多具有比原天然產(chǎn)物更強(qiáng)的抗腫瘤、抗菌或抗氧化等生物活性〔5〕。5-Fu是臨床上常見的抗腫瘤藥物，常用于治療消化道癌、直腸癌、乳腺癌等實(shí)體腫瘤，但其嚴(yán)重副作用如腹瀉、脫水、腹痛、惡心等限制了它在臨床的應(yīng)用〔6〕。Phen具有芳香體系的性質(zhì)，自身還有兩個可以配位的氮原子，因而可形成穩(wěn)定的鰲合配體，被廣泛用于構(gòu)筑配合物〔7〕。如果將具有抗腫瘤作用的5-Fu與具有較強(qiáng)配位能力的Phen作為配體，與金屬鐵離子結(jié)合形成配合物，既有可能產(chǎn)生多種物質(zhì)抗腫瘤的協(xié)同作用，增強(qiáng)其抗腫瘤作用，同時又有降低毒性的可能性。由此，我們以鐵為中心原子，5-Fu和Phen為配體合成鐵-氟尿嘧啶配合物，初步鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。有研究報道，鐵配合物中的鐵離子可以通過參與芬頓反應(yīng)（即過氧化氫與二價鐵離子反應(yīng)生成了具有較強(qiáng)氧化能力的羥基自由基）來誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，活性氧形成的自由基通過損傷細(xì)胞膜磷脂、酶或DNA造成對細(xì)胞的不可逆損傷，激活線粒體途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用〔8〕。鐵配合物也可以通過直接與DNA作用〔9〕，即插入到堿基對之間破壞DNA的結(jié)構(gòu)，從而表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒活性。本研究將對合成的鐵-氟尿嘧啶配合物的細(xì)胞毒活性及其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，探討配合物未來成藥的可能性，為研發(fā)一類抗癌新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣品和試劑［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］（批號：2014-12-24，昆明學(xué)院化學(xué)系鐘文遠(yuǎn)教授提供）；鐵鹽（FeSO4·7H2O）（批號：121207，西隴化工股份有限公司）；5-Fu（批號：990420，上海華聯(lián)制藥公司）；Phen（批號：980611，上海試劑三廠）；順鉑（批號：130802，云南個舊生物藥業(yè)有限公司）；新生牛血清（Gibco公司生產(chǎn)，批號：1128143）；RPMI-1640（BI公司生產(chǎn)，批號：0044515）；引物見表1（天根公司）。

表1 目的基因的引物序列

1.2細(xì)胞株人白血病細(xì)胞（K562）；人結(jié)直腸癌細(xì)胞（HCT-116）；人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）；人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）；人肝癌細(xì)胞（HEPG-2），以上細(xì)胞株均由昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。

1.3儀器超純水系統(tǒng)（力康公司生產(chǎn)，NW基礎(chǔ)型）；電子天平（德國Sartorius公司生產(chǎn)，CPA224S型）；電熱恒溫水浴鍋（上海恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，HWS12型）；恒溫干燥箱（德國MMM公司生產(chǎn)，Venticell型）；醫(yī)用冰箱（合肥美菱公司生產(chǎn)，YCD-EL259型）；超凈工作臺（珠海再鑫公司生產(chǎn)，EVL-53型）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國SHELLAB公司生產(chǎn)，2406型）；全波長酶標(biāo)儀（美國Mollecular Devices公司生產(chǎn)，Plus 384型）；倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司生產(chǎn)，CKX31型）；熒光倒置顯微成像系統(tǒng)（德國Leica公司生產(chǎn)，DMI3000B型）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司生產(chǎn)，F(xiàn)ACSCantoTMII型）；實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Applied biosystems公司生產(chǎn)，7500型）；低溫高速離心機(jī)（Sigma公司生產(chǎn)，3-18KS）；普通低速離心機(jī)（上海菲恰爾公司生產(chǎn)，TDL-4A型）。

1.4受試樣品配制將［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］用DMSO（二甲基亞砜）配成10-1mol/L母液；FeSO4·7H2O、5-Fu、Phen和順鉑用NS（生理鹽水）配成10-2mol/L母液，然后均用NS稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L的5個濃度備用；溶劑對照為相應(yīng)濃度的DMSO。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞用含10%新生牛血清的RP?MI-1640完全培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞毒活性取對數(shù)生長期的K562、HCT-116、SGC-7901、MCF-7和HEPG-2細(xì)胞，按9 000個/孔的數(shù)目接種于96孔板，90 μL/孔，各組均設(shè)3個復(fù)孔。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入各受試樣品10 μL，樣品終濃度10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L；樣品作用48 h后，加入MTT（噻唑藍(lán)），10 μL/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入三聯(lián)液（10%十二烷基硫酸鈉-5%異丁醇-0.012 mol/L HCl），100 μL/孔；放置過夜后用酶標(biāo)儀于570 nm，630 nm雙波長下檢測各孔的OD值，計算增殖抑制率。采用GWBASIC軟件計算IC50值及95%置信區(qū)間。

1.7 Hoechst 33342/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡以［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］和順鉑作用于SGC-7901細(xì)胞后的IC50值為受試濃度。取SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106個/mL，種入12孔培養(yǎng)板，200 μL/孔，24 h后加入受試樣品。樣品作用24 h后，棄舊培養(yǎng)基，加入850 μL新培養(yǎng)基，加入Hoechst 33342（100 μg/mL，100 μL/孔），使其終濃度為10 μg/mL；加入PI（100 μg/mL，50 μL/孔）使其終濃度為5 μg/mL。放入培養(yǎng)箱孵育15 min，于熒光顯微鏡下拍照。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡根據(jù)［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］、5-Fu、Phen和順鉑作用于SGC-7901細(xì)胞后的IC50值，以1/2IC50、IC50、2IC50為低、中、高3個受試濃度，檢測樣品作用SGC-7901細(xì)胞24、36、48 h后的早期凋亡率；同時，檢測［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］、5-Fu、Phen和順鉑以同一濃度10-5mol/L作用SGC-7901細(xì)胞36 h后的早期凋亡率。取SGC-7901細(xì)胞，以1×106個/瓶的數(shù)目接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，24 h后加入受試樣品，樣品作用24、36、48 h后收集約5×105~10×105個細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min。參照Annexin V-FITC試劑盒說明書：離心后加入1 mL預(yù)冷PBS洗滌2次，1 200 r/min離心5 min。離心后棄上清，加100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞；加5 μL AnnexinV-FITC和5 μL Propidium Iodide混勻；室溫、避光反應(yīng)10 min；加入400 μL Binding Buffer混勻。在1 h內(nèi)，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.9 RT-qPCR檢測凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)情況取SGC-7901細(xì)胞，以6×105個/孔的數(shù)目接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h后加入受試樣品。［Fe（5-Fu）（2Phen）SO4］、5-Fu、Phen和順鉑以10-5mol/L濃度作用12、24、36 h后用Trazol提取總RNA。按FastQuant RT Kit（With gDNase）試劑盒說明書：配制10 μL反應(yīng)體系去除基因組DNA；配制20 μL反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。參照SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒說明書：配制20 μL反應(yīng)體系，用實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。采用比較循環(huán)閾值法（2-△△Ct）分析樣本中Caspase-3、Bax和Bcl-2基因的相對表達(dá)量。

1.10數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各指標(biāo)以表示。采用prise軟件建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行方差分析，組間比較P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體對5株人癌細(xì)胞增殖的影響［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體以10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L濃度作用于5株人癌細(xì)胞后，以濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)繪制量效曲線，見圖1，并計算IC50值，見表2。從圖1可以看出，在10-8~10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體5-Fu、Phen對K562、HCT-116、SGC-7901、MCF-7和HEPG-2細(xì)胞的增殖抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)。

表2 及其配體對5株人癌細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）

表2 及其配體對5株人癌細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）

對于K562細(xì)胞，在10-6、10-5、10-4mol/L濃度時，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對細(xì)胞的抑制率分別為-3%、12%、38%；5-Fu為-3%、5%、33%；Phen為7%、51%、66%；順鉑為1%、13%、95%。見圖1A。［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］、5-Fu、Phen和順鉑的IC50分別為7.8×10-5、1.0×10-4、2.4×10-5、2.1×10-5mol/L。

對于HCT-116細(xì)胞，在10-6、10-5、10-4mol/L濃度時，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對細(xì)胞的增殖抑制率分別為-1%、28%、59%；5-Fu為-2%、15%、32%；Phen為3%、43%、52%；順鉑為6%、22%、73%。見圖1B。IC50分別為5.4×10-5、9.8×10-5、4.9×10-5、3.5×10-5mol/L。［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對HCT-116細(xì)胞有較強(qiáng)增殖抑制作用，10-4mol/L作用后的抑制率與NS相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其作用強(qiáng)于配體5-Fu和Phen。

對于SGC-7901細(xì)胞，在10-6、10-5、10-4mol/L濃度時，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］作用后的增殖抑制率分別為22%、31%、64%；5-Fu為7%、24%、35%；Phen為-4%、35%、45%；順鉑為3%、75%、97%。見圖1C。IC50分別為3.5×10-5、3.0×10-4、5.5×10-5、7.8×10-6mol/L。［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對SGC-7901細(xì)胞有較強(qiáng)增殖抑制作用，10-4mol/L作用后的抑制率與NS相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其作用強(qiáng)于配體5-Fu和Phen。

對于MCF-7細(xì)胞，在10-6、10-5、10-4mol/L濃度時，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對細(xì)胞的增殖抑制率分別為1%、24%、51%；5-Fu為-3%、18%、30%；Phen為-4%、44%、55%；順鉑為-2%、33%、93%。見圖1D。IC50分別為5.5×10-5、8.4×10-5、4.5×10-5、2.6×10-5mol/L。［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng)，10-4mol/L作用后的抑制率與NS相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其作用強(qiáng)于配體5-Fu。

圖1 ［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體對5株人癌細(xì)胞的增殖抑制作用

對于HEPG-2細(xì)胞，在10-6、10-5、10-4mol/L濃度時，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對細(xì)胞的增殖抑制率分別為19%、41%、67%；5-Fu為0%、28%、45%；Phen為10%、31%、44%；順鉑為0%、32%、66%。見圖1E。IC50分別為2.2×10-5、5.8×10-5、1.3×10-4、4.2×10-5mol/L。［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對HEPG-2細(xì)胞有較強(qiáng)增殖抑制作用，10-4mol/L作用后的抑制率與NS相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），強(qiáng)于5-Fu和Phen，甚至強(qiáng)于順鉑。

在所測試濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)eSO4·7H2O對5株人癌細(xì)胞不但沒有增殖抑制作用，相反，還有一定的促增殖作用。見圖1。以10-5mol/L作用后對HCT-116、SGC-7901細(xì)胞的促增殖率達(dá)71%和82%。見圖1B、圖1C。

2.2 Hoechst 33342/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡順鉑、［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］以各自作用于SGC-7901細(xì)胞后求出的IC50值7.8×10-6mol/L、3.5×10-5mol/L作用SGC-7901細(xì)胞24 h后，用Hoechst 33342/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。從圖2中看出，未經(jīng)染色處理的NS組細(xì)胞形態(tài)正常；而順鉑組和［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］組細(xì)胞皺縮。經(jīng)過染色處理后，順鉑組和［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］組有明顯亮藍(lán)色凋亡細(xì)胞出現(xiàn)（圖2E、圖2F中箭頭處）。見圖2。

圖2 Hoechst33342/PI雙染法檢測［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響（20×10）

2.3［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］以1.75×10-5（1/2IC50）、3.50×10-5（IC50）、7.00×10-5mol/L（2IC50）為低、中、高濃度；5-Fu以1.50×10-4（1/2IC50）、3.00×10-4（IC50）、6.00×10-4mol/L（2IC50）為低、中、高濃度；Phen以2.75×10-5（1/2IC50）、5.50×10-5（IC50）、1.10×10-4mol/L（2IC50）為低、中、高濃度；順鉑以7.80×10-6mol/L（IC50）作用于SGC-7901細(xì)胞24、36、48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。見圖3~4。

從圖4看出，樣品作用24 h后，順鉑組早期凋亡率為42.7%。［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］低、中、高濃度組早期凋亡率為5.8%、7.9%、17.3%，與NS組相比，配合物高濃度時明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。5-Fu低、中、高濃度組早期凋亡率為6.5%、33.1%、25.2%，與NS組相比，中、高濃度時明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。Phen低、中、高濃度組早期凋亡率為8.4%、11.5%、16.5%，與NS組相比，高濃度時明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。

作用36 h后，順鉑組早期凋亡率為17.7%。［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］低、中、高濃度作用SGC-7901細(xì)胞后，早期凋亡率為26.5%、31.6%、43.8%，與NS組相比，配合物中、高濃度時明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。5-Fu低、中、高濃度組早期凋亡率為30.9%、36.6%、38.6%，與NS組相比，低、中、高濃度均明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。Phen低、中、高濃度組早期凋亡率為30.8%、36.0%、37.2%，與NS組相比，均明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。

作用48 h后，順鉑組早期凋亡率為19.3%。［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］低、中、高濃度組早期凋亡率為14.6%、27.7%、26.7%，與NS組相比，配合物中、高濃度組明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。5-Fu低、中、高濃度組早期凋亡率為24.1%、24.1%、27.0%，與NS組相比，均明顯地誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（P＜0.01）。

當(dāng)［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］、5-Fu、Phen和順鉑以10-5mol/L作用SGC-7901細(xì)胞36 h后，其早期凋亡率分別為9.8%、2.4%、2.2%和15.8%。與NS組相比，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（P＜0.01），且［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］誘導(dǎo)凋亡的作用強(qiáng)于其配體5-Fu和Phen（P＜0.01）。見圖5。

圖3 ［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體作用SGC-7901細(xì)胞36 h后對細(xì)胞凋亡的影響

圖4 ［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

圖5 ［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體以相同濃度作用SGC-7901細(xì)胞后對凋亡的影響

2.4［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體作用于SGC-7901細(xì)胞后對凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響RT-qPCR結(jié)果表明，與NS組相比，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體以10-5mol/L濃度作用于SGC-7901細(xì)胞12、24、36 h后，使Caspase-3、Bax基因的mRNA表達(dá)上調(diào)，使Bcl-2基因的mRNA表達(dá)下調(diào)。見圖6。

對于Caspase-3基因，與NS組相比，經(jīng)順鉑、［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］、5-Fu和Phen作用于SGC-7901細(xì)胞12 h后，其表達(dá)分別上調(diào)至1.9、2.4、1.5、1.6；作用24 h后，其表達(dá)分別上調(diào)至2.7（P＜0.05）、3.2（P＜0.01）、1.6、2.3（P＜0.05）；作用36 h后，其表達(dá)分別上調(diào)至11.1（P＜0.01）、4.9（P＜0.01）、1.9、4.9（P＜0.01）。

圖6 ［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］作用SGC-7901細(xì)胞后對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

對于Bax基因，順鉑、［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］、Phen作用SGC-7901細(xì)胞12 h后分別上調(diào)至1.2、1.3、1.3，而5-Fu使其表達(dá)下調(diào)至0.9；作用24 h后，其表達(dá)分別上調(diào)至2.7、1.7、1.1、1.9；作用36 h后，順鉑、5-Fu、Phen使其表達(dá)分別上調(diào)至3.3、1.2、2.1，而［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］使其表達(dá)下調(diào)至0.7。

對于Bcl-2基因，順鉑、［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］、Phen作用SGC-7901細(xì)胞12 h后，使其表達(dá)分別下調(diào)至0.2（P＜0.01）、0.5、0.7，而5-Fu使其表達(dá)上調(diào)至1.1；作用24 h后，順鉑、［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］使其表達(dá)下調(diào)至0.1（P＜0.05）和0.8，而5-Fu、Phen使其表達(dá)上調(diào)至1.4和1.3；作用36 h后，順鉑、［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］使其表達(dá)下調(diào)至0.2（P＜0.01）和0.3（P＜0.05），而5-Fu、Phen使其表達(dá)上調(diào)至1.1和1.3。

3 討論

本研究在成功合成［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］的基礎(chǔ)上，測定了［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體對K562、HCT-116、SGC-7901、MCF-7和HEPG-2細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。在10-6、10-5、10-4mol/L濃度時，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］對5株細(xì)胞的細(xì)胞毒活性均強(qiáng)于配體5-Fu；對于HCT-116、SGC-7901和HEPG-2細(xì)胞，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］細(xì)胞毒活性強(qiáng)于配體Phen；而配體FeSO4·7H2O對5株細(xì)胞均表現(xiàn)出促增殖作用，這可能與腫瘤對鐵需求較高有關(guān)〔10〕。以上說明了配合物的合成，使配體之間產(chǎn)生了協(xié)同抗腫瘤作用。

細(xì)胞增殖與凋亡的平衡是機(jī)體正常生長的關(guān)鍵，腫瘤的發(fā)生就是由于細(xì)胞異常增殖和凋亡受抑所導(dǎo)致，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示：低、中、高濃度［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體5-Fu和Phen均能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡，早期凋亡率從24 h到36 h呈上升趨勢，36 h達(dá)高峰，36 h到48 h呈下降趨勢。隨著濃度增加，配合物誘導(dǎo)細(xì)胞的早期凋亡率呈上升趨勢，顯現(xiàn)良好的量效關(guān)系。順鉑誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡的早期凋亡率在作用24 h后達(dá)到高峰，36、48 h后呈下降趨勢，說明順鉑起效時間早于配合物及其配體。當(dāng)［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］、5-Fu和Phen以10-5mol/L濃度作用SGC-7901細(xì)胞36 h后，［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］誘導(dǎo)凋亡作用明顯強(qiáng)于其配體5-Fu和Phen，再次說明配合物的合成，使配體之間產(chǎn)生了協(xié)同抗腫瘤作用。

在細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Caspase家族起著十分重要的作用。Caspase-3是經(jīng)典的死亡受體途徑和線粒體途徑的共同下游因子，是哺乳動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶〔11-13〕。而Bcl-2蛋白家族與凋亡密切相關(guān)，其中，Bax和Bcl-2分別是Bcl-2家族中的促凋亡和抗凋亡成員之一，在細(xì)胞凋亡過程中起調(diào)節(jié)作用〔14-15〕。本研究結(jié)果顯示，在10-5mol/L濃度時，隨著作用時間延長，順鉑使促凋亡基因Caspase-3和Bax顯著上調(diào)，使抑凋亡基因Bcl-2顯著下調(diào)。而［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］及其配體5-Fu和Phen作用細(xì)胞后，使促凋亡基因Caspase-3和Bax表達(dá)上調(diào)；［Fe（5-Fu）2（Phen）SO4］作用細(xì)胞后，使抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)，作用36 h后下調(diào)明顯。5-Fu、Phen對Bcl-2基因表達(dá)幾乎無下調(diào)作用，甚至一定程度上上調(diào)其表達(dá)。本研究將進(jìn)一步研究配合物誘導(dǎo)凋亡的具體途徑，并且探索配合物對DNA分子的作用情況，以及揭示配合物抗腫瘤作用的具體機(jī)制、關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)。

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Research on Anti-tumor Activity of Iron-fluorouracil Complex

Du Xin'e1,Zhou Yun2,Chen Yingjie3,Shi Min1,Zhong Wenyuan4,Zhou Yiping1*
（1.Pharmaceutical Science,Kunming Medical University,Kunming 650500,China;2.College of Chemistry,Yunnan Open University, Kunming 650223,China;3 School of Basic Medicine,Kunming Medical University,Kunming 650500,China;4.Department of Chemistry,Kunming University,Kunming 650214,China）

Objective:To explore iron-fluorouracil complex's anti-tumor activity and effect to human gastric carcinoma cells apoptosis.Methods:MTT method was used to detect inhibition rate of the complex on tumor cell lines:K562,HCT-116,SGC-7901, MCF-7 and HEPG-2;Hoechst 33342/PI and flow cytometry（FCM）methods were used to exhibit apoptosis of SGC-7901 cells;RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of apoptosis related factors:Caspase-3,BaxandBcl-2.Results:Iron-fluorouracil complex obviously inhibited the proliferation of 5 tumor cell lines.IC50were 7.8×10-5,5.4×10-5,3.5×10-5,1.1×10-4and 2.2×10-5mol/L, respectively.After 36 hours'treatment on SGC-7901 cell with a concentration 10-5mol/L,its apoptosis rate was 9.8%,which could promote SGC-7901 cell apoptosis than its ligands 5-Fu and Phen（P＜0.01）;the mRNA expression ofCaspase-3gene was up-regulated to 4.9（P＜0.01）,whileBcl-2was down-regulated to 0.2（P＜0.01）.Conclusion:The complex showed good anti-tumor activity in vitro,up regulation ofCaspase-3as well as down regulationBcl-2may be one of its mechanisms of action.

iron-fluorouracil complex;cytotoxicity;apoptosis

R96

A

2096-2266（2017）02-0011-09

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.02.003

（責(zé)任編輯 李楊）

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)資助項(xiàng)目（2014FB011）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2014Z060）

2016-04-06

2016-06-14

杜馨娥，碩士研究生，主要從事腫瘤藥理研究.

*通信作者：周軼平，副教授，博士.