李婷，喬婷婷，劉俊勇，沈琦，彭芳*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.上海交通大學藥學院，上海200240）

美洲大蠊提取物逆轉(zhuǎn)Bel-7402/5-Fu多藥耐藥性實驗研究

李婷1，喬婷婷1，劉俊勇1，沈琦2，彭芳1*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.上海交通大學藥學院，上海200240）

目的：探討美洲大蠊提取物逆轉(zhuǎn)Bel-7402/5-Fu多藥耐藥性的作用及機制。方法：MTT法檢測Bel-7402/5-Fu的多藥耐藥性及美洲大蠊CⅡ-3和脫脂膏的無毒劑量；Bel-7402/5-Fu細胞線粒體膜電位及Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達情況。結(jié)果：Bel-7402/5-Fu對5-Fu表現(xiàn)出較高的耐藥性，耐藥倍數(shù)為66.42。CⅡ-3的使用劑量低于93.37 μg/mL，脫脂膏的使用劑量低于47.81 μg/mL。CⅡ-3和脫脂膏能降低線粒體膜電位，且CⅡ-3較脫脂膏作用強；能抑制Bel-7402/5-Fu細胞Bcl-2蛋白表達，抑制作用隨藥物劑量增加而加強；促進Bax蛋白表達，促進作用隨劑量增加而加強；激活下游通路中Caspase-3，Caspase-9蛋白表達，且與劑量成正相關(guān)。結(jié)論：美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏能夠有效逆轉(zhuǎn)Bel-7402/5-Fu的多藥耐藥性，其作用機制主要通過降低線粒體膜電位和調(diào)控Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達。

美洲大蠊；逆轉(zhuǎn)；肝癌；多藥耐藥性

多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR）是指在腫瘤的治療中，腫瘤復發(fā)后對曾經(jīng)使用過的有效抗腫瘤藥物以及未曾用過的作用和作用機制尚不明確的其他抗腫瘤藥物作用無效〔1-2〕。

MDR產(chǎn)生機制相對復雜，主要包括以下幾種：①高度表達的多藥耐藥關(guān)聯(lián)蛋白，較多的有P-糖蛋白（P-glycoprotein）、乳腺癌耐藥蛋白、肺耐藥相關(guān)蛋白以及其他多藥耐藥蛋白；②影響藥物代謝；③影響藥物作用的靶點；④細胞凋亡受抑制。腫瘤MDR的產(chǎn)生還可能與細胞DNA修復、微管蛋白相關(guān)蛋白、蛋白激酶C、體內(nèi)激素、腫瘤血管形成以及線粒體凋亡等多種因素有關(guān)〔3-4〕。

由于MDR的出現(xiàn)，腫瘤治療作用并無顯著提高，即使是一些抗癌效果很好的新藥，也通常因為耐藥性的存在而失去應有的效果。因此要改善現(xiàn)有腫瘤的化療方案，提高其有效性，就要對MDR機制進行深入研究，尋求有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑是其必然道路〔5-7〕。本研究以人肝癌耐藥細胞株Bel-7402/ 5-Fu為研究對象，應用美洲大蠊提取物通過體外逆轉(zhuǎn)其耐藥性，觀察藥物作用效果并探討逆轉(zhuǎn)MDR的作用機制。

1 材料

1.1細胞株人肝癌細胞株Bel-7402、耐5-氟尿嘧啶人肝癌細胞Bel-7402/5-Fu，均購自上海美軒生物科技有限公司。

1.2藥物來源及制備美洲大蠊提取物CⅡ-3（黃褐色凍干粉末）和脫脂膏（褐色黏稠膏狀），均由云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室張成桂博士提供。

美洲大蠊脫脂膏的制備：將美洲大蠊全蟲干燥后進行粉碎，用70%乙醇冷浸提取3次，將所得乙醇液進行合并、濃縮、提取獲得浸膏〔8〕。

美洲大蠊提取物CⅡ-3的制備：將美洲大蠊脫脂膏上聚酰胺柱，依次應用水及不同比例的含水甲醇洗脫，定量收集，分別濃縮。其中某一段的濃縮液經(jīng)冷凍干燥后即為所用樣品〔9〕。

1.3主要試劑及儀器胎牛血清（Solarbio）；RPMI-1640（Gibco）；MTT（噻唑藍，Solarbio）；DMSO（二甲基亞砜，Solarbio）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天）；線粒體膜電位檢測試劑盒（碧云天）；一抗：Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9，Bax（BD）；二抗：Anti-Mouse IgG（H+ L），Antibody（KPL）。阿霉素（ADM，山西普德）；長春新堿（VCR，齊魯制藥）；維拉帕米（VRP，天津風船）；5-氟尿嘧啶（5-Fu，天津金耀氨基酸有限公司）。

CO2培養(yǎng)箱（BB16UV/BB5060UV）；酶標儀（Thermo scientific）；電泳儀（BIO-RAD）；垂直電泳槽（BIO-RAD）；Transilluminator UV/white 2020D（HFC386STD-V12）；Cold Springs及Kodakl20凝膠成像系統(tǒng)（MVE CRYOSYSTEM 4000）。

2 方法

2.1 Bel-7402和Bel-7402/5-Fu細胞培養(yǎng)Bel-7402細胞接種在含適量RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，Bel-7402/5-Fu細胞用含25 μg/mL 5-Fu的培養(yǎng)液在相同條件下培養(yǎng)維持耐藥性，經(jīng)傳代和收集，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 Bel-7402/5-Fu細胞多藥耐藥性檢測取對數(shù)生長期的Bel-7402、Bel-7402/5-Fu細胞進行培養(yǎng)，待細胞長成單層后，加入不同濃度的化療藥物（5-Fu：0.2、1.0、5.0、25.0、125.0 μg/mL，ADM：0.2、0.8、3.2、12.8、51.2 μg/mL，VCR：0.25、1.00、4.00、16.00、64.00 μg/mL）。每個濃度設5個復孔，同時設不加藥物作為對照組。按MTT法常規(guī)處理，自動酶標儀上測各組OD值（570 nm波長）。計算細胞抑制率（Inhibition Rate，IR）和耐藥倍數(shù)（Resistance Index，RI）。

細胞抑制率IR（%）=［1-（A加藥組-A空白組）/（A對照組-A空白組）］×100%

耐藥倍數(shù)RI=耐藥細胞IC50／敏感細胞IC50

2.3美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對耐藥細胞毒性檢測將Bel-7402/5-Fu對數(shù)生長期細胞配成2×105個/mL細胞懸液進行培養(yǎng)，并進行4種不同方式的處理，處理1是Bel-7402/5-Fu+不同濃度CⅡ-3/脫脂膏，處理2是Bel-7402/5-Fu+0.5%DMSO，處理3是Bel-7402/5-Fu+完全培養(yǎng)液，處理4是只加完全培養(yǎng)液。其中CⅡ-3和脫脂膏的終濃度分別為300、100、30、10和3 μg/mL。按MTT法常規(guī)處理，于570 nm波長的酶標儀上測光密度值，并計算各組藥物對細胞的抑制率，再測算出IC50、IC10。

細胞抑制率IR（%）=［1-（A加藥組-A空白組）（/A對照組-A空白組）］×100%

2.4美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對耐藥細胞線粒體膜電位的影響實驗分組同“2.3項”。不同濃度藥物及相應溶劑對照處理細胞48 h后，收集細胞，適量RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，加入Rho123染液，令其終濃度為5 μg/mL，37°C避光孵育30 min，離心后PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測Rh123熒光強度，以熒光強度平均值表示細胞內(nèi)Rho123濃度。實驗重復3次。

2.5美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對耐藥細胞Bcl-2、Bax及Caspase-9，Caspase-3蛋白表達的影響實驗分組同“2.3項”。不同濃度藥物及相應溶劑對照處理細胞48 h后，收集細胞，加入細胞裂解液，置冰上振搖30 min提取蛋白樣品。進行蛋白免疫印跡法常規(guī)處理，檢測Bcl-2、Bax及Caspase-9，Caspase-3的蛋白變化。

2.6統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，結(jié)果用表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 Bel-7402和Bel-7402/5-Fu細胞多藥耐藥性檢測Bel-7402對5-Fu、ADM、VCR的IC50分別為（6.96±1.33）、（0.61±0.07）、（13.94±5.06）mg/mL；Bel-7402/5-Fu對5-Fu、ADM、VCR的IC50分別為（482.06±265.11）、（5.54±0.23）、（66.20±11.10）mg/mL。Bel-7402/5-Fu對5-Fu的耐藥倍數(shù)為66.42>15.00，有高度耐藥性；對ADM的耐藥倍數(shù)為5.00<9.13< 10.00，有中度耐藥性；對VCR的耐藥倍數(shù)為5.06，有低度耐藥性。見表1。

表1 Bel-7402/5-Fu與Bel-7402細胞藥物敏感性

表1 Bel-7402/5-Fu與Bel-7402細胞藥物敏感性

3.2美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對耐藥細胞毒性檢測應用MTT法檢測美洲大蠊提取物CⅡ-3和美洲大蠊脫脂膏的IC50和IC10，由于逆轉(zhuǎn)性實驗要排除受試藥對細胞的影響，因此我們使用小于IC10的藥物劑量進行逆轉(zhuǎn)實驗研究。美洲大蠊提取物CⅡ-3對BEL-7402/5-Fu的IC10為（93.37±12.04）μg/mL；美洲大蠊脫脂膏對BEL-7402/5-Fu的IC10為（47.81±10.26）μg/mL。其中美洲大蠊脫脂膏與CⅡ-3比較，發(fā)現(xiàn)相同抑制率情況下脫脂膏用量較CⅡ-3用量少，且差異具有統(tǒng)計學意義。最終確定美洲大蠊提取物CⅡ-3的逆轉(zhuǎn)劑量低于93.37 μg/mL，而美洲大蠊脫脂膏的逆轉(zhuǎn)劑量低于47.81 μg/mL。見表2。

表2 CII-3與脫脂膏無毒劑量篩選

表2 CII-3與脫脂膏無毒劑量篩選

注：CⅡ-3與脫脂膏比較**P＜0.01。

3.3美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對耐藥細胞線粒體膜電位的影響與耐藥空白組對比，CⅡ-3和脫脂膏波峰均左移，熒光強度降低，說明二者對線粒體膜電位降低有一定作用；與陽性組對比，CⅡ-3組波峰與其相當，脫脂膏組波峰右移，說明CⅡ-3較脫脂膏作用強。見圖1。

圖1 CⅡ-3和脫脂膏對線粒體膜電位的影響

3.4美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對耐藥細胞Bcl-2、Bax及Caspase-9，Caspase-3蛋白表達的影響由圖2可知親本細胞Bax表達量高于耐藥細胞，Bcl-2表達量低于耐藥細胞；與耐藥空白組比較，CⅡ-3和脫脂膏可以激活Caspase-3，Caspase-9的表達。應用Western blotting方法檢測人肝癌Bel-7402/5-Fu細胞Bcl-2及Bax蛋白表達情況，結(jié)果顯示，CⅡ-3和脫脂膏能抑制Bel-7402/5-Fu抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達，且抑制作用隨CⅡ-3和脫脂膏劑量的增加而加強；能夠促進凋亡因子Bax蛋白的表達，促進作用隨劑量的增加而增強；能夠激活下游通路中Caspase-3，Caspase-9蛋白的表達，且與劑量成正相關(guān)。高濃度的脫脂膏較CⅡ-3對Caspase-9蛋白的作用強；低濃度的CⅡ-3較脫脂膏對Caspase-3的作用強。見表3。

圖2 CⅡ-3和脫脂膏對耐藥細胞Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9蛋白表達的影響

表3 美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對耐藥細胞Bax，Bcl-2，Caspase-9，Caspase-3蛋白表達的影響

表3 美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對耐藥細胞Bax，Bcl-2，Caspase-9，Caspase-3蛋白表達的影響

注：與空白對照Bel-7402/5-Fu組比較*P<0.05，**P<0.01；與CⅡ-3高劑量組比較#P<0.05；與脫脂膏低劑量組比較※P<0.05。

4 討論

MDR不僅影響了化療效果，也是誘導肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因〔10〕，其作用機制十分復雜，需要多種因素共同參與，通過不同途徑來完成，主要有耐藥相關(guān)蛋白的表達，藥物代謝相關(guān)酶活性表達和凋亡抑制途徑異常等〔11〕。誘導細胞凋亡受抑制是腫瘤細胞發(fā)生MDR的主要機制之一，主要包括線粒體途徑和死亡受體途徑兩個主要通路受抑制，其中線粒體依賴性細胞凋亡通路是抗癌藥物誘導細胞凋亡的一條重要通路〔12〕。本研究通過美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對肝癌耐藥細胞株中多藥耐藥相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，探討美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏對肝癌多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及可能的作用機制。

本研究以人肝癌細胞株Bel-7402和耐藥細胞株Bel-7402/5-Fu為研究對象，通過檢測細胞對化療藥物敏感性，可看出Bel-7402/5-Fu細胞對多種化療藥物的抑制率均高于Bel-7402細胞，且對5-Fu顯示較強的耐藥性，這說明Bel-7402/5-Fu細胞耐藥性較好。在細胞毒性劑量篩選實驗中，選擇非毒性劑量作為逆轉(zhuǎn)劑量，確定美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏的逆轉(zhuǎn)劑量分別為（81.33±12.04）μg/mL、（37.55±10.26）μg/mL，在此最大劑量范圍內(nèi)對細胞無明顯毒副作用。

Western blotting檢測結(jié)果表明敏感細胞中Bax含量高于耐藥株，Bcl-2含量低于耐藥細胞株，經(jīng)藥物CⅡ-3和脫脂膏誘導后，耐藥株中Bax表達增強，且促進作用隨藥物濃度的增加而增強；耐藥株中Bcl-2表達量降低，抑制作用隨CⅡ-3和脫脂膏濃度的增加而增強；能夠激活下游通路中Caspase-9，Caspase-3蛋白的表達，且呈劑量依賴性關(guān)系。藥物的作用可以增強促凋亡蛋白Bax的表達，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量，使線粒體膜電位下降，繼而激活引導者Caspase-9，進一步活化其下游的Cas?pase-3，最終誘導細胞發(fā)生凋亡是線粒體途徑誘導細胞凋亡的可能機制。

美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏具有一定的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用，為拓展美洲大蠊提取物CⅡ-3與脫脂膏聯(lián)合常規(guī)化療藥物應用于臨床肝癌耐藥性的治療，提高抗腫瘤藥物的化療效果，為促進臨床合理用藥提供實驗依據(jù)和理論支持。另外，耐藥機制復雜多變，是多靶點、多因子綜合作用的結(jié)果，在今后實驗中，還應該進一步驗證美洲大蠊提取物CⅡ-3與脫脂膏逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥的作用機制是否與其他機制有關(guān)（如P53，微管與微管蛋白，MAPK信號轉(zhuǎn)導通路等），以及在體內(nèi)實驗中進一步驗證美洲大蠊提取物CⅡ-3與脫脂膏逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥的作用，再做臨床前藥效學評價，為肝癌化療聯(lián)合使用美洲大蠊提取物CⅡ-3與脫脂膏克服肝癌多藥耐藥提供新策略。

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Research of Extracts from Periplaneta americana on Reversing Multi-drug Resistance to Bel-7402/5-Fu

Li Ting1,Qiao Tingting1,Liu Junyong1,Shen Qi2,Peng Fang1*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.School of Pharmacy,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China）

Objective:To investigate the effect and mechanism of extracts fromPeriplaneta americanaon reversing multi-drug resistance to Bel-7402/5-Fu.Methods:Multi-drug resistance to cancer agents and nontoxic dose of thePeriplaneta americanaextract CⅡ-3 and skim cream were evaluated by MTT assay.The effect of mitochondrial membrane potential and expressions of Bcl-2,Bax, Caspase-9 and Caspase-3 were detected in Bel-7402/5-Fu cells affected with CⅡ-3 and skim cream.Results:Bel-7402/5-Fu cells showed high resistance to 5-Fu,the resistance ratio was 66.42.The dose of CⅡ-3 was lower than 93.37 μg/mL,and the dose of skim cream was lower than 47.81 μg/mL.CⅡ-3 and the skimmed cream could decrease mitochondrial membrane potential and CⅡ-3 was stronger than the skimmed cream.CⅡ-3 and the skimmed cream could inhibit the Bcl-2 protein expression of Bel-7402/5-Fu and the inhibition effect increased with the dose amount;could promote the expression of Bax protein and the promoting effect increased with the dose amount;could activate downstream pathways of Caspase-9,Caspase-3,and the promoting effect increased with the dose amount.Conclusion:ThePeriplaneta americanaextract CⅡ-3 and the skimmed cream can effectively reverse MDR in Bel-7402/5-Fu cells.The mechanism is to decrease of mitochondrial membrane potential,and regulate the expression of Bcl-2,Bax,Caspase-9 and Caspase-3 protein.

Periplaneta americana;reversion;Hepatocellular carcinoma;multi-drug resistance

R752.1

A

2096-2266（2017）02-0001-05

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.02.001

（責任編輯 李楊）

云南省應用基礎研究計劃資助項目（2013FA043）

2016-08-09

2016-09-15

李婷，碩士研究生，主要從事抗腫瘤藥理學研究. *通信作者：彭芳，教授.