凡 超，邵雪花，匡石滋，田世堯，賴 多

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/ 農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

發(fā)光桿菌（Photorhabdus luminescens）是一種昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的共生細(xì)菌，革蘭氏染色為陰性，兼性厭氧［1］。自1990年Ensign等［2］首次報道發(fā)光桿菌與蘇云金桿菌一樣可產(chǎn)生胞外殺蟲蛋白，昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌引起了國內(nèi)外學(xué)者的興趣，并進(jìn)行了大量的研究。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)光桿菌對煙草天蛾、小菜蛾、菜青蟲、斜紋夜蛾、大蠟螟、棉鈴蟲等鱗翅目多種害蟲有較高的生物活性［2-6］。此外，發(fā)光桿菌還能夠產(chǎn)生蒽醌類、羥化二苯乙烯類、細(xì)菌素和幾丁質(zhì)酶類等多種抑菌物質(zhì)［7-8］，抑制其他微生物的生長，尤其對荔枝霜疫霉病菌、蘋果灰霉病菌、擬莖點霉病菌、冬瓜枯萎病菌、番茄菌核病菌、蘿卜褐腐病菌、黃瓜灰霉病菌、馬鈴薯環(huán)腐病菌、煙草青枯病菌等多種植物病原具有廣泛的抑制作用［9-12］。也有研究報道，發(fā)光桿菌對植物病原線蟲具有致死或抑制活性［13-14］。在發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)呼聲越來越高的今天，發(fā)光桿菌作為一類新型的具有開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的生物資源，在植物病蟲害生物防治中具有越來越重要的作用［15］。

開發(fā)活體微生物可濕性粉劑在現(xiàn)代農(nóng)藥制劑中具有廣泛的適用范圍，許多微生物殺菌劑往往加工成可濕性粉劑。但是，目前對發(fā)光桿菌的研究主要集中在分離、活性篩選和代謝物鑒定等方面，尚沒有關(guān)于其劑型加工的報道。而加工成活體農(nóng)藥時，不同種類的助劑（如載體、潤濕劑和分散劑等）對發(fā)光桿菌的存活和活性影響有著非常大的差異。因此，本研究通過對載體、潤濕劑和分散劑的種類和用量進(jìn)行考察優(yōu)化，研制發(fā)光桿菌可濕性粉劑，以提高其制劑的生防效果，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)；同時測定其對荔枝采后貯藏性能的影響，這對豐富荔枝果實采后保鮮生物材料具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：發(fā)光桿菌（P. luminescens）Hb1029，由農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室分離保藏；培養(yǎng)條件參考孫東磊等［12］的方法。

果實：荔枝品種為桂味，2017年7月20日采摘于廣州市增城區(qū)荔枝種植園，采后立刻運回實驗室，試驗中選擇無病蟲害、無機(jī)械損傷、成熟度及大小一致的果實。

農(nóng)藥助劑載體：硅藻土、碳酸鈣、高嶺土；分散劑：羧甲基纖維素鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、亞甲基雙荼磺酸鈉；潤濕劑：十二烷基苯磺酸鈉、拉開粉（丁基萘磺酸鈉）、茶枯粉；保護(hù)劑：糊精、海藻酸鈉、可溶性淀粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物相容性測定 采用稀釋平板計數(shù)法，將50 mg/mL載體、0.25 mg/mL潤濕劑、1.5 mg/mL分散劑、50μg/mL保護(hù)劑分別與融化的營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基混合，滅菌后制成平板。取 100μL 稀釋至不同倍數(shù)（103、104、105…109）的發(fā)光桿菌稀釋液，均勻涂布于混合培養(yǎng)基平板上，以不添加助劑的NA培養(yǎng)基作為對照，每個處理3次重復(fù)，置于28℃下培養(yǎng)，24 h后計算各平板的發(fā)光桿菌菌落數(shù)。

1.2.2 助劑的篩選與最佳配比的確定 載體篩選：選擇對發(fā)光桿菌菌落生長沒有影響或者影響很小的載體，結(jié)合其對制劑理化性質(zhì)、成本等方面的因素確定最佳載體。

潤濕劑與分散劑的篩選：參照王劍等［16］的方法略作修改，在菌粉中分別添加一定量的潤濕劑與分散劑，混合均勻，即制得不同助劑的制劑。按照GB/T 5451-2001標(biāo)準(zhǔn)［17］測定各制劑的潤濕時間，比較潤濕性能的好壞，潤濕時間越短，潤濕性越好。按照GB/T 14825-2006標(biāo)準(zhǔn)［18］測定各制劑的懸浮率，比較各種分散劑的分散效果，懸浮率越高，分散性越好。同時測定各潤濕劑、分散劑與發(fā)光桿菌的生物相容性。綜合考慮潤濕時間、懸浮率以及生物相容性確定最佳的分散劑、潤濕劑。

保護(hù)劑篩選：將菌體稀釋液涂布在含保護(hù)劑的平板上，以不含保護(hù)劑的平板作對照。用254 nm UV紫外燈（20 W）照射1 min后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，計算菌落數(shù)。

以篩選出的最佳載體、潤濕劑、分散劑和保護(hù)劑為變量因素，采用四因素三水平L9（34）正交設(shè)計進(jìn)行試驗。將各種助劑分別過38 mm篩，按正交設(shè)計的比例加入菌粉，攪拌均勻加工成可濕性粉劑，然后測定各制劑的潤濕性和懸浮率，確定配方各組分的最佳比例。

1.2.3 粉劑性能的測定 粉劑中發(fā)光桿菌活菌數(shù)的檢測通過稀釋涂布NA平板，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，鏡檢計數(shù)。潤濕時間按GB/T 5451-2001標(biāo)準(zhǔn)［17］測定。懸浮率按GB/T 14825-2006標(biāo)準(zhǔn)［18］測定。pH值按GB/T 1600-1993標(biāo)準(zhǔn)［19］測定。細(xì)度通過45 mm標(biāo)準(zhǔn)篩大于 95% 測定［20］。

1.2.4 對荔枝采后貯藏影響的測定 貯藏保鮮試驗于2017年7月20日在恒溫房進(jìn)行，將制備的發(fā)光桿菌可濕性粉劑用無菌水稀釋成1×108CFU/mL的懸浮液，對荔枝進(jìn)行表面噴施處理，以噴施無菌水的荔枝作為對照。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)30個果實。待荔枝自然晾干后，裝入塑料袋，封口，置于25℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏，7 d后觀察記錄荔枝的腐爛指數(shù)和商品率。

腐爛指數(shù)及商品率的測定參照Wu等［21］方法并略作修改。根據(jù)果實腐爛面積大小，將腐爛指數(shù)分為5級：0級，無腐爛、無病斑；1級，腐爛面積占果實面積的比例小于10%；2級，腐爛面積占果實面積10%～25%；3級，腐爛面積占果實面積25%～50%；4級，腐爛面積大于總果實面積50%。計算腐爛指數(shù)和荔枝商品率：

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan's或Tukey's多重比較分析處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的篩選

試驗結(jié)果（表1）表明：碳酸鈣對發(fā)光桿菌菌落生長有明顯抑制作用，與對照差異顯著；而高嶺土和硅藻土與對照差異不顯著，表明兩者均對發(fā)光桿菌菌落的生長沒有影響。將高嶺土和硅藻土分別與菌粉加工成粗制劑后，兩種制劑的潤濕時間差異不顯著，但是以硅藻土作為載體時，制劑的懸浮率達(dá)到51.33%，明顯高于高嶺土和碳酸鈣。因此，硅藻土可作為發(fā)光桿菌可濕性粉劑的理想載體。

表1 載體對發(fā)光桿菌菌落及制劑理化性質(zhì)的影響

2.2 潤濕劑和分散劑的篩選

由表2可知，以茶枯粉為潤濕劑，制劑的潤濕時間和懸浮率均最優(yōu)，并且菌落數(shù)高達(dá)187個，明顯高于以十二烷基苯磺酸鈉和拉開粉為潤濕劑的制劑，表明茶枯粉對發(fā)光桿菌菌落生長影響最小，而十二烷基苯磺酸鈉和拉開粉顯著地抑制發(fā)光桿菌的生長，因此選擇茶枯粉為潤濕劑。以木質(zhì)素磺酸鈉為分散劑，制劑的潤濕性能最好，潤濕時間僅為53 s，但是木質(zhì)素磺酸鈉和亞甲基雙荼磺酸鈉菌對發(fā)光桿菌菌落生長具有明顯的抑制作用，與對照差異顯著；羧甲基纖維素鈉盡管潤濕時間較長，但其分散狀況最優(yōu)，懸浮率高達(dá)84.67%，并且對發(fā)光桿菌菌落生長沒有抑制作用，故選擇羧甲基纖維素鈉作為分散劑。

表2 不同潤濕劑和分散劑對發(fā)光桿菌菌落及制劑理化性質(zhì)的影響

2.3 保護(hù)劑的篩選

由表3可知，紫外線照射1 min后，以糊精為保護(hù)劑，對發(fā)光桿菌菌落生長保護(hù)效果最好，存活率最高，達(dá)到55.37%；而海藻酸鈉和可溶性淀粉的保護(hù)作用不明顯。因此，選擇糊精作為制劑的保護(hù)劑。

表3 保護(hù)劑對發(fā)光桿菌菌落生長的保護(hù)效果

2.4 可濕性粉劑最佳配比的確定

通過上述單因素的篩選，可以確定硅藻土、茶枯粉、羧甲基纖維素鈉和糊精為發(fā)光桿菌可濕性粉劑的最佳助劑，進(jìn)一步以這4種助劑為篩選因素，以3個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平進(jìn)行正交試驗（表4），結(jié)果見表5。以懸浮率為指標(biāo)，由極差大小判斷，各因素對制劑懸浮率影響次序為：B（茶枯粉）＞C（羧甲基纖維素鈉）＞A（硅藻土）＞D（糊精）；從平均值分析，A1B2C2D2為最佳組合，即硅藻土40%、茶枯粉4%、羧甲基纖維素鈉6%、糊精0.2%。

表4 助劑篩選的因素和水平

2.5 發(fā)光桿菌可濕性粉劑質(zhì)量指標(biāo)測定

可濕性粉劑各項指標(biāo)測定結(jié)果表明，發(fā)光桿菌活菌數(shù)大于5.0×108CFU/g，pH值6.8，潤濕時間51 s，懸浮率74.83%，水分含量2.87%，細(xì)度通過率98.52%，各項檢測結(jié)果均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

表5 助劑正交試驗結(jié)果

2.6 發(fā)光桿菌可濕性粉劑對荔枝采后貯藏的影響

從圖1（彩插四）可以看出，貯藏7 d后，未經(jīng)菌劑處理的對照荔枝果實大部分出現(xiàn)腐爛、褐變現(xiàn)象，部分果實表面布滿了白色菌絲；而經(jīng)發(fā)光桿菌可濕性粉劑處理的荔枝果實保持鮮艷和完整，僅少量果實表面發(fā)生小面積褐變。調(diào)查結(jié)果顯示，菌劑處理果實的腐爛指數(shù)僅為0.13，極顯著低于對照0.89。室溫貯藏7 d后，對照的果實商品率僅為6.67%，而菌劑處理的商品率高達(dá)90%。表明噴施發(fā)光桿菌可濕性粉劑對荔枝果實具有良好的保鮮作用，能有效降低果實的腐爛指數(shù)，提高果實的商品率。

圖1 發(fā)光桿菌可濕性粉劑對荔枝果實采后貯藏的影響

3 結(jié)論與討論

農(nóng)藥中可濕性粉劑不使用溶劑和乳化劑，對植物較為安全，既提高了經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，又保護(hù)生態(tài)環(huán)境，是當(dāng)前發(fā)展綠色環(huán)保農(nóng)業(yè)的重要方式。但是，微生物可濕性粉劑中的助劑，不僅對制劑的理化性質(zhì)影響很大，而且對微生物本身活性也有著密切關(guān)系，因此必須考慮助劑與微生物兩者的相容性。通過菌落計算法研究了可濕性粉劑中硅藻土、茶枯粉、羧甲基纖維素鈉等常用助劑與發(fā)光桿菌的生物相容性，通過正交試驗對載體、潤濕劑、分散劑和保護(hù)劑的篩選，確定了發(fā)光桿菌可濕性粉劑的最佳配方為：硅藻土40%、茶枯粉4%、羧甲基纖維素鈉6%、糊精0.2%，且制備的制劑各項指標(biāo)符合質(zhì)量要求，為發(fā)光桿菌可濕性粉劑的研制提供了技術(shù)參考。

微生物可濕性粉劑中的載體盡管作為一種惰性填料，但是不同種類的載體對活體微生物影響差異很大。張敏等［22］報道了載體硅藻土不影響木霉菌分生孢子萌發(fā)及菌絲生長，可作為其可濕性粉劑載體，而凹凸棒土顯著抑制木霉菌的分生孢子萌發(fā)及菌絲生長，相容性較差。王志英等［23］則研究發(fā)現(xiàn)硅藻土與蘇云金桿菌、白僵菌的相容性較差，而凹凸棒土對蘇云金桿菌芽孢萌發(fā)以及白僵菌分生孢子萌發(fā)、菌落生長基本沒有影響，可作為兩者可濕性粉劑的載體。本研究結(jié)果顯示硅藻土與發(fā)光桿菌有較好的相容性，但碳酸鈣和高嶺土?xí)种破渚渖L。由此可見，不同種類的載體、潤濕劑和分散劑對微生物的存活和活性影響有著非常大的差異，即使同一載體，對不同種類的微生物也會產(chǎn)生不一樣的效果。因此，在研制不同微生物可濕性粉劑時，必須針對所涉及的菌株，對載體、潤濕劑和分散劑的種類進(jìn)行篩選，以提高其生防效果。

荔枝霜疫霉菌是荔枝果實上的一種重要病害，不僅會造成大量落果和爛果，還嚴(yán)重影響荔枝鮮果的貯藏。以往研究表明，發(fā)光桿菌對荔枝霜疫霉菌具有良好的抑菌活性［24］。因此，本文對研制的發(fā)光桿菌可濕性粉劑在荔枝果實采后貯藏上應(yīng)用進(jìn)行了探索，結(jié)果表明噴施發(fā)光桿菌可濕性粉劑能有效降低荔枝果實的腐爛指數(shù)，提高果實的商品率，這可能與發(fā)光桿菌抑制荔枝果實表面的霜疫霉菌生長有關(guān)。本研究為發(fā)光桿菌可濕性粉劑在荔枝采收貯藏保鮮上提供了新思路，但是對于發(fā)光桿菌是否影響荔枝果實采后貯藏品質(zhì)還有待進(jìn)一步探討。

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