吳建國(guó)，馬利，楊彬君，吳巖斌，吳錦忠，黃家興（.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州50；.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州50；.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物及化學(xué)科技學(xué)系，香港999077）

虎奶菇多糖納米硒對(duì)叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

吳建國(guó)1，馬利2，楊彬君2，吳巖斌1，吳錦忠1，黃家興3
（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122；3.香港理工大學(xué)應(yīng)用生物及化學(xué)科技學(xué)系，香港999077）

目的觀察虎奶菇多糖納米硒（PTR-SeNPs）對(duì)叔丁基過(guò)氧化氫（t-BHP）誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。方法不同給藥濃度的PTR-SeNPs作用24 h，5 μmol／L的t-BHP作用HepG2細(xì)胞1 h，建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果10-1～10-4μmol／L的PTR-SeNPs能顯著改善t-BHP對(duì)HepG2細(xì)胞細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)論P(yáng)TR-SeNPs對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用。

虎奶菇多糖納米硒；叔丁基過(guò)氧化氫；HepG2細(xì)胞；氧化損傷；保護(hù)作用

我們前期研究利用虎奶菇菌核多糖作為封端劑，在亞硒酸鈉（硒源）和抗壞血酸（還原劑）的還原系統(tǒng)中成功制備出一種大小可控且高度穩(wěn)定的新型納米硒，即虎奶菇多糖納米硒（PTR-SeNPs）。研究結(jié)果顯示，以PSP修飾的納米硒具有優(yōu)質(zhì)的生物理化特性，較納米硒分散更均勻，不易聚集［1］。本文研究PTR-SeNPs對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與儀器

1.1 材料PTR-SeNPs（香港理工大學(xué)應(yīng)用生物及化學(xué)科技學(xué)系黃家興副教授制備并提供，初始濃度為1.29 mol／L）；HepG2細(xì)胞（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC細(xì)胞庫(kù)）；磷酸鹽緩沖鹽溶液PBS、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清FBS（美國(guó)Gibco公司）；0.22 μm微孔濾膜（美國(guó)Corning公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、叔丁基過(guò)氧化氫（t-BHP）（美國(guó)Sigma公司）；二甲基亞砜DMSO、青霉素-鏈霉素雙抗試劑（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器BCD-518WSA冰箱（中國(guó)海爾集團(tuán)有限公司）；SW-CJ-1FDA超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；Eppendorf移液器、5417R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Anke TDL-50B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HF212UV CO2培養(yǎng)箱（香港Heal Force公司）；LX-800酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-tek公司）；P.O.Box 649 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）。

2 方法

2.1 含藥培養(yǎng)液的制備取PTR-SeNPs、t-BHP用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液（含1%青霉素-鏈霉素）稀釋后，配置成不同終濃度的含藥培養(yǎng)液，以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后密封，保存于4℃，備用。

2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液（含1%青霉素-鏈霉素）的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2空氣飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。

2.3 PTR-SeNPs和t-BHP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，于96孔板中每孔接種1×105／mL細(xì)胞懸液100 μL，每組6個(gè)復(fù)孔，孵育24 h后，加入10-4、10-3、10-2、10-1、1、10 μmol／L的PTR-SeNPs，或含t-BHP終濃度為0、2.5、5、10、20、40、60、80、120、240 μmol／L的完全培養(yǎng)基，每孔100 μL作用1和2 h后，吸棄各孔培養(yǎng)基，分別加入100 μL的1 mg／mL MTT，37℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫分析儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度（OD）值。根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率：

2.4 PTR-SeNPs對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，于96孔板中每孔接種1×105／ml細(xì)胞懸液100 μL，每組6個(gè)復(fù)孔，貼壁24 h，進(jìn)行分組?？瞻捉M繼續(xù)以100 μL的培養(yǎng)基孵育24 h，不加任何干預(yù)因素；模型組以100 μL培養(yǎng)基培養(yǎng)23 h后，改換含等體積的5 μmol／L的t-BHP培養(yǎng)基溶液繼續(xù)培養(yǎng)1 h；PTRSeNPs給藥組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中，加入100 μL的1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol／L的PTR-SeNPs干預(yù)23 h，改換50 μL的10 μmol／L的t-BHP和50 μL的2×10-4、2×10-3、2×10-2、2×10-1、2、20 mol／L的PTR-SeNPs培養(yǎng)1 h，加入20 μL 5%的MTT鹽酸緩沖鹽溶液，37℃孵育4 h，去除上清液，加入150 μL的DMSO溶液振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，置入用酶聯(lián)免疫分析儀在570 nm處檢測(cè)吸光度值，計(jì)算各組的細(xì)胞活力。

3 結(jié)果

3.1 PTR-SeNPs和t-BHP對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用見(jiàn)表1。

表1 不同濃度PTR-SeNPs對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

表1顯示不同給藥濃度的PTR-SeNPs均能顯著抑制細(xì)胞的增殖（P＜0.001），當(dāng)濃度為10-4～1 μmol／L時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞具有一定的抑制作用，抑制率為11.86%～17.80%。當(dāng)濃度為10 μmol／L，PTRSeNPs對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，抑制率達(dá)到36.44%。圖1顯示藥物作用1 h后，不同濃度的t-BHP均能顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖（P＜0.001），呈劑量依賴關(guān)系；藥物作用2 h后，t-BHP給藥濃度≤60 μmol／L時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)（P＜0.001），呈劑量依賴關(guān)系，但當(dāng)給藥劑量大于此濃度，抑制率均大于90%，劑量依賴關(guān)系不明顯。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用5μmol／L的t-BHP作用時(shí)間1 h，其抑制率為37.06%（P＜0.001）作為HepG2細(xì)胞氧化損傷模型建立的條件。

3.2 PTR-SeNPs對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用見(jiàn)表2。由表2可知，當(dāng)PTR-SeNPs終濃度為10 μmol／L時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞有顯著抑制作用，其細(xì)胞活力顯著低于模型組（P＜0.01）。當(dāng)給藥濃度為1 μmol／L時(shí)，其細(xì)胞活力與模型組無(wú)顯著性差異。當(dāng)PTR-SeNPs給藥濃度≤10-1，其細(xì)胞活力大于模型組，具有明顯的保護(hù)作用。細(xì)胞活力隨著濃度的降低，細(xì)胞活力增強(qiáng)，與PTR-SeNPs本身對(duì)HepG2細(xì)胞具有一定的抑制作用有關(guān)。

圖1 不同濃度的t-BHP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用圖

表2 不同濃度PTR-SeNPs對(duì)t-BHP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

4 討論

近年來(lái)，納米硒替代無(wú)機(jī)硒的研究引起了廣泛的關(guān)注，因其具有生物利用度高、活性強(qiáng)、毒性低的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)納米硒的體內(nèi)活性研究結(jié)果表明，灌胃給予納米硒能夠明顯減小因環(huán)磷酰胺引起的Swiss albino小鼠肝損傷及基因毒性，主要表現(xiàn)為顯著降低小鼠體內(nèi)的MDA和ROS水平，提高GSH含量，恢復(fù)抗氧化酶活性，減少染色體畸變以及淋巴球和骨髓的DNA損傷［2］。本研究結(jié)果證實(shí)PTR-SeNPs能顯著改善t-BHP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷。

［1］WU H L，LI X L，LIU W，et al.Surface decoration of selenium nanoparticles by mushroom polysaccharide-protein complexes to achieve enhanced cellular uptake and anti-cancer activity［J］.J Mater Chem，2012，22（19）：9602-9610.

［2］BHATTACHARJEE A，BASU A，GHOSH P，et al.Protective effect of Selenium nanoparticle against cyclophosphamide induced hepatotoxicity and genotoxicity in Swiss albino mice［J］.J Biomater Appl，2014，29（2）：303-317.

R285.5

A

1000-338X（2017）01-0045-02

2017-01-03

吳建國(guó)（1982—），男，助理研究員，主要從事藥用真菌的藥效物質(zhì)研究。

黃家興（1979—），男，副教授。E-mail：kahing.wong@polyu. edu.hk