付貝貝，周紫婷，覃威，陳詩雅，鄭云夢，邱少斌，蔡晶（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122）

松果菊苷對帕金森病模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元GSK-3β蛋白的影響

付貝貝，周紫婷，覃威，陳詩雅，鄭云夢，邱少斌，蔡晶
（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122）

目的研究松果菊苷對PD模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元GSK-3β蛋白表達(dá)的影響。方法取雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、PD模型組、松果菊苷治療組，用6-OHDA立體定向微量注射于大鼠右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束制備帕金森病（PD）大鼠模型，用Western Blot檢測4組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元GSK-3β蛋白的表達(dá)。結(jié)果在相同條件下，PD模型組的大鼠海馬區(qū)GSK-3β蛋白的表達(dá)量高于正常組，用松果菊苷治療后，GSK-3β蛋白的表達(dá)量降低（P＜0.01）。結(jié)論松果菊苷可影響大鼠海馬區(qū)患側(cè)Wnt／β-catenin通路GSK-3β蛋白的表達(dá)，對帕金森病有一定的治療作用。

帕金森??；松果菊苷；GSK-3β蛋白；Wnt通路

松果菊苷是從肉蓯蓉中提取的有效成分，具有明顯的抗氧化、抗神經(jīng)元凋亡、抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶能力等作用［1-4］。我們通過6-OHDA立體定向微量注射于大鼠右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束制備帕金森?。≒arkinson's disease，PD）大鼠模型，觀察探討松果菊苷通過大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元Wnt／β-catenin通路中GSK-3β蛋白表達(dá)的影響，研究松果菊苷治療對帕金森病的的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取雄性SD大鼠48只，福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量（200～220）g。飼養(yǎng)條件：福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物飼養(yǎng)室，光照12 h，黑暗12 h，室溫（20±2）℃，自由飲食與飲水，大鼠全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑肉蓯蓉購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，從中提取松果菊苷；6-羥基多巴胺（6-OHDA）、阿撲嗎啡（APO）、GSK-3β蛋白（美國Cell Signaling Technolegy公司）；抗壞血酸（美國Sigma公司）。

1.3 儀器外科手術(shù)器械、微量注射器、帕金森動(dòng)物旋轉(zhuǎn)檢測儀（美國Columbus instruments公司）；SR－6N型顱腦定位儀（日本Narishige公司）、Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀、電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.4 PD模型分組及假手術(shù)組的制備48只SD大鼠按每籠4只飼養(yǎng)于通氣籠具，飼養(yǎng)2周后，取正常組12只，其它36只進(jìn)行模型制備，造模前12 h禁食不禁水，稱體質(zhì)量后隨機(jī)取36只大鼠腹腔注射10%水合氯醛（30 mg／kg）。麻醉后，頭頂部去毛，碘酒、乙醇消毒，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，沿顱頂正中線切開皮膚，鈍性分離顱骨外膜，暴露大鼠顱骨的前囟門。參照大鼠腦定位立體圖譜，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，確定前腦內(nèi)側(cè)束的三坐標(biāo)：前囟后4.8 mm，矢狀縫右側(cè)1.2 mm，硬腦下7.8 mm，用顱骨鉆鉆孔，用微量注射器將6-OHDA立體定向注射，注射量8 μg，濃度2 μg／μL，溶解于含0.1%抗壞血酸的生理鹽水中。注射速度1 μL／min，注射后留針10 min，緩慢出針，局部消毒縫合頭皮。用骨蠟封閉大鼠腦部的顱骨孔，常規(guī)消毒，縫合皮膚。假手術(shù)組11只，手術(shù)過程同上，注射等量生理鹽水，正常組不做處理。術(shù)后7 d，每日腹腔注射青霉素100萬U／kg預(yù)防感染。

1.5 PD模型組篩選及松果菊苷治療組干預(yù)造模3周后，皮下注射阿撲嗎啡0.5 mg／kg，溶解于含0.1%抗壞血酸的生理鹽水中，于旋轉(zhuǎn)檢測儀中誘導(dǎo)大鼠檢測其旋轉(zhuǎn)，記錄30 min內(nèi)大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，每min恒定轉(zhuǎn)向左側(cè)且旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于或等于7圈的模型為成功的模型20只，將成功的模型隨機(jī)平均分成PD模型組10只，松果菊苷治療組10只。

挑選出造模成功大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，治療組每日灌胃松果菊苷溶液，濃度5 mg／mL，灌胃量40 mg／kg。給藥時(shí)間上午10時(shí)，連續(xù)10 d，每周稱體質(zhì)量1次，調(diào)整給藥量，其余3組灌等體積的生理鹽水。

1.6 取材處理大鼠取仰臥位在解剖臺(tái)上，固定四肢，接著用20%烏拉坦（5 mL／kg）腹腔注射麻醉，剪開腹部皮膚，暴露腹腔。沿著腹中線和胸骨中線向上剪開胸骨，沿著膈肌向兩側(cè)皮膚剪開，并用止血鉗將胸骨和胸部皮膚鉗緊，將止血鉗翻向外側(cè)以充分暴露心臟，將剪除針尖的灌注針由左心室推入升主動(dòng)脈固定，夾閉胸主動(dòng)脈，灌注等滲鹽水（37℃），灌流量20 mL／min。剪開右心耳，當(dāng)流出液體清亮?xí)r，用4%多聚甲醛（4℃）進(jìn)行固定，先快速灌注50 mL，再緩慢灌注50 mL，固定液進(jìn)入大鼠血管后，頸部僵硬后完成固定。隨即迅速斷頭取腦，在枕骨大孔處斜插入剪刀剪開頂骨，用止血鉗掰斷兩端頂骨，注意嗅球上的頂骨也要仔細(xì)的去掉，用剪刀于一側(cè)剪斷視神經(jīng)并探測到顱底，就可以將整塊的腦組織翹起，小心地從枕骨大孔將腦組織置于4%多聚甲醛中，放4℃冰箱固定4 h。

1.7 Western blot檢測GSK-3β蛋白表達(dá)勻漿上清用Brad-ford法進(jìn)行蛋白定量，用SDS-PAGE對蛋白樣品進(jìn)行分離，分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非公價(jià)健的形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物活性不變。印跡先用5%的BSA或脫脂奶粉溶液處理以封閉NC膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，室溫下封閉液作用1 h，再加入用封閉液稀釋的1∶1000一抗（兔抗鼠GSK-3β蛋白和磷酸化GSK-3β蛋白單克隆抗體）4℃過夜；洗液洗滌3 min×3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記稀釋的1∶1000二抗孵育2 h，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯示蛋白條帶，感光在膠片上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 觀測指標(biāo)用Western blot蛋白印記法，以β-actin作為參照，分析GSK-3β蛋白表達(dá)量的變化。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果雄性SD大鼠48只，造模過程中死亡3只，PD模型組、松果菊苷治療組誘導(dǎo)后旋轉(zhuǎn)的老鼠20只，進(jìn)入研究43只，其中正常組12只，假手術(shù)組11只，PD模型組10只，松果菊苷治療組10只。

2.2 WesternBlot結(jié)果見表1、圖1。

表1 4組大鼠海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)的灰度值比較

表1 4組大鼠海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)的灰度值比較

注：與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01；治療組組內(nèi)左右側(cè)比較，5）P＜0.05。

組別模型組假手術(shù)組正常組治療組海馬左側(cè)右側(cè)左側(cè)右側(cè)左側(cè)右側(cè)左側(cè)右側(cè)GSK-3β 16468175.33±2282272.9252）15242614.67±2112192.8732）10400872.00±1390922.347 12844433.33±1762210.252 10994847.00±1535084.625 10166038.00±1353377.093 11620531.00±1628166.9391）3）12023535.33±1701206.3801）3）5）β-actin 5485267.33±51177.520 5507117.00±39022.320 5522873.33±53960.124 5496912.33±70483.927 5493591.67±75988.139 5515395.00±38210.527 5519321.67±22695.639 5516301.33±37196.415 GSK-3β／β-actin 3.0050±0.44502）2.7692±0.39912）1.8847±0.2686 2.3395±0.3508 2.0041±0.3076 1.8442±0.2572 2.1062±0.30361）3）2.1809±0.32251）3）5）

圖14 組大鼠海馬區(qū)GSK-3β蛋白電泳圖

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)中通過6-OHDA為選擇性DA神經(jīng)元化學(xué)損毀劑，當(dāng)注射至大鼠紋狀體后可被DA神經(jīng)元末梢通過軸突逆轉(zhuǎn)運(yùn)至黑質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞體內(nèi)；或注射至大鼠黑質(zhì)內(nèi)時(shí)，6-OHDA與DA競爭攝取位點(diǎn)，能被攝取到細(xì)胞中。胞體的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)6-OHDA到細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)氧化生成神經(jīng)毒物質(zhì)，如羥自由基和醌類，使DA神經(jīng)元的抗氧化系統(tǒng)破壞，線粒體功能損傷，膜穩(wěn)定性和DNA完整性破壞，使細(xì)胞變性、死亡。Gong等［5］研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA通過抑制Akt活性激活GSK-3β，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，GSK-3β也參與調(diào)節(jié)了神經(jīng)元凋亡過程。因此，GSK-3β抑制劑可阻斷帕金森病患者神經(jīng)元損傷。3.2實(shí)驗(yàn)表明，PD模型組中由于顱內(nèi)注射6-OHDA，在GSK-3β蛋白，表達(dá)水平高于正常組。說明Wnt／β-catenin通路中，6-OHDA通過抑制Akt活性激活GSK-3β蛋白使其表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)。Santra等［6－9］研究結(jié)果也有相似表現(xiàn)。在松果菊苷治療組中，GSK-3β蛋白表達(dá)低于PD模型組，說明ECH的干預(yù)治療對GSK-3β蛋白表達(dá)起到一定的抑制作用。6-OHDA導(dǎo)致大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷，導(dǎo)致沒有Wnt配體去激活該通路，因此PD模型組GSK-3β蛋白的表達(dá)水平增加。在用松果菊苷干預(yù)治療以后，松果菊苷治療組GSK-3β蛋白的表達(dá)低于模型組。

綜上所述，松果菊苷可通過發(fā)揮類GSK-3β蛋白抑制劑的作用，調(diào)控帕金森病大鼠模型海馬區(qū)Wnt／β-catenin通路的GSK-3β蛋白的表達(dá)量來改善帕金森病的癥狀。

［1］楊明會(huì)，李敏，竇永起，等.補(bǔ)腎活血顆粒對帕金森病患者運(yùn)動(dòng)功能的影響：多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2010，8（3）：231-237.

［2］李敏，楊明會(huì)，劉毅，等.補(bǔ)腎活血顆粒治療帕金森病運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥臨床研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（6）：1296-1299.

［3］李敏，楊明會(huì)，劉毅，等.補(bǔ)腎活血顆粒對帕金森病患者四肢肌張力的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（3）：599-601.

［4］李敏，楊明會(huì)，竇永起，等.補(bǔ)腎活血顆粒對帕金森病患者肱二頭肌肌張力的影響［J］.中藥材，2011，34（3）：490-493.

［5］GONG L，ZHANG Q L，ZHANG N，et al.Neuroprotection by urate on6-OHDA-lesioned rat model of Parkinson’s disease：Linking to Akt／GSK3β signaling pathway［J］.J Neurochem，2012，123（5）：876-885.

［6］GOLPICH M，AMINI E，HEMMATI F，et al.Glycogen synthase kinase-3beta（GSK-3β）signaling：Implications for Parkinson’s disease［J］.Pharmacol Res，2015，97：16-26.

［7］王蘇雷，徐運(yùn).Wnt信號(hào)通路在阿爾茨海默病中的研究進(jìn)展［J］.神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2013，13（4）：416-419.

［8］趙若聰，劉瓊，何曉陽，等.線粒體動(dòng)力學(xué)失衡和環(huán)境神經(jīng)毒物對阿爾茨海默病病理進(jìn)程影響的研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27（1）：101-105.

［9］SANTRA S，XU L，SHAH M，et al.D-512 and D-440 as novelmultifunctional dopamine agonists：Characterization of neuroprotectionproperties and evaluation ofin vivoefficacy in a Parkinson's diseaseanimal model［J］.ACS Chem Neurosci，2013，4（10）：1382-1392.

R285.5

A

1000-338X（2017）01-0037-03

2016-12-07

國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金資助課題（WKJ－FJ-38）

付貝貝（1994—），女，2013級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，主要從事中西醫(yī)結(jié)合老年神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。

蔡晶（1960—），女，教授。E-mail：caiji@163.com