郭陽麗，邱梁楨，林翔，王曉穎（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸聚合物膠束制備工藝

郭陽麗，邱梁楨，林翔，王曉穎
（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的優(yōu)化載紫杉醇（PTX）的羧甲基殼聚糖-大黃酸聚合物膠束制備工藝。方法以載藥量、包封率、粒徑為考察指標(biāo)，對(duì)載藥和透析方法進(jìn)行單因素考察，確定PTX／CR聚合物膠束的最佳制備工藝。結(jié)果最佳載藥方法為透析法，最佳載藥工藝以乙醇（30 mg／mL）作為PTX溶劑，載體CR濃度為7 mg／mL，藥載比1∶1.4。結(jié)論CR聚合物通過物理包載PTX形成載藥量和包封率較好、粒徑小的載藥聚合物膠束。

紫杉醇；羧甲基殼聚糖-大黃酸；聚合物膠束；制備工藝

聚合物膠束能夠作為口服給藥的載體對(duì)紫杉醇進(jìn)行有效的體內(nèi)遞送［1］，我們以CR聚合物為載體材料，制備載PTX的CR聚合物膠束（PTX／CR聚合物膠束），考察CR聚合物膠束對(duì)PTX的載藥能力，為PTX在體內(nèi)的口服遞送提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器XS205十萬分之一電子天平（梅特勒-

托利多儀器上海有限公司）；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波市芝生物科技股份有限公司）；ALPHA1-2 LD冷凍干燥機(jī)（德國Christ公司）；TDL-80-2B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海市安亭科學(xué)儀器廠）；NICOMPTM 380ZLS激光粒徑測(cè)定儀（美國Santa Bbarbara公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試劑與材料羧甲基殼聚糖-大黃酸聚合物（自制）；甲醇、二氯甲烷（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；無水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；丙酮（衡陽市凱信化工試劑有限公司，分析純）；透析袋（上海市綠鳥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：140412）；紫杉醇（PTX）（上海市中西三維藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201501004）。

2 方法

2.1 PTX含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-SP（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（65∶35）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：227 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取PTX 3 mg，置10 mL瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為312 μg／mL的儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液，以甲醇為溶劑，稀釋配制濃度為62.4、25、12.5、6.24、2.5、1.25、0.250 μg／mL的PTX溶液，按2.1.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。

2.1.3 回收率配制40、20、1 μg／mL高、中、低3種濃度的PTX溶液，按2.1.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PTX含量及回收率。

2.1.4 精密度取濃度40.8、20.4、1.2 μg／mL的PTX溶液，同日連續(xù)測(cè)5次及3天連續(xù)測(cè)定，按2.1.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)差、日間差。

2.1.5 最低檢測(cè)限與最低定量限PTX溶液分別取20 μL進(jìn)樣，以信噪比（S／N）為3∶1時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度作為該分析方法的最低檢測(cè)限（LOD），以S／N為10∶1時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度作為該分析方法的最低定量限（LOQ）。

2.2 包封率和載藥量測(cè)定PTX在水中的溶解度非常低（＜6 μg／mL），水中的游離藥物與載入膠束的藥物量（＞2 mg／mL）相比，可以忽略不計(jì)。PTX／CR聚合物膠束溶液3 500 r／min離心10 min，上清液過濾，取200 μL的濾過液置10 mL瓶中，用甲醇稀釋至刻度，0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液按2.1.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算PTX含量，計(jì)算載入膠束中的PTX量。

2.3 載藥方法考察

2.3.1 直接溶解法取CR聚合物18 mg，加蒸餾水3 mL，室溫下攪拌溶解后，冰水浴探頭超聲10 min，加入PTX粉末10 mg，攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，蒸餾水透析12 h，冰水浴探頭超聲20 min，3 500 r／min離心10 min，上清液用0.8 μm濾膜過濾，得PTX／CR聚合物膠束溶液。

2.3.2 乳化法取CR聚合物18 mg，加蒸餾水3 mL，室溫下攪拌溶解后，冰水浴探頭超聲10 min，然后逐滴滴加30 mg／mL PTX二氯甲烷溶液330 μL，攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，室溫敞口攪拌過夜12 h，揮發(fā)溶劑，冰水浴探頭超聲20 min，3 500 r／min離心10 min，上清液用0.8 μm濾膜過濾，得PTX／CR聚合物膠束溶液。

2.3.3 透析法取CR聚合物18 mg，加蒸餾水3 mL，室溫下攪拌溶解后，冰水浴探頭超聲10 min，逐滴滴加30 mg／mL PTX無水乙醇溶液330 μL，攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，蒸餾水透析12 h，冰水浴探頭超聲20 min，3 500 r／min離心10 min，上清液用0.8 μm濾膜過濾，得PTX／CR聚合物膠束溶液。

2.4 透析法工藝優(yōu)化取CR聚合物18 mg，加蒸餾水室溫下攪拌溶解，冰水浴探頭超聲10 min，將PTX溶于有機(jī)溶劑中，滴加于CR聚合物溶液中，攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，蒸餾水透析12 h，冰水浴探頭超聲20 min，3 500 r／min離心10 min，上清液用0.8 μm濾膜過濾，得PTX／CR聚合物膠束溶液。

2.4.1 PTX溶劑篩選固定CR聚合物的質(zhì)量為18 mg，PTX的質(zhì)量為10 mg，分別用甲醇、乙醇、丙酮、DMF、DMSO溶解配制成濃度為30 mg／mLPTX溶液。

2.4.2 藥物與載體投料比固定CR聚合物的重量為18 mg，PTX的濃度為30 mg／mL，以乙醇為溶劑，考察PTX與CR聚合物1∶1、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.2、1∶2.6的重量比對(duì)CR聚合物膠束載藥的影響。

2.4.3 載體濃度固定PTX與CR聚合物的重量比為1∶1.4，PTX的溶劑為乙醇，PTX的濃度為30 mg／mL，考察4、5、6、7、8 mg／mLCR聚合物膠束對(duì)載藥的影響。

2.5 粒徑及分布測(cè)定取不同載藥工藝所得的PTX／CR聚合物膠束溶液，用水稀釋至濃度0.5 mg／mL，用動(dòng)態(tài)光散射方法測(cè)定粒徑及粒徑分布。

3 結(jié)果

3.1 PTX含量測(cè)定方法的建立

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍按2.1.1項(xiàng)色譜條件分析，線性回歸方程以峰面積（A）對(duì)濃度（C）作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得：

A＝46585C－15413r＝0.9999

結(jié)果表明在0.2～60.0 μg／mL線性關(guān)系良好。

3.1.2 回收率與精密度高、中、低3個(gè)濃度水平的回收率分別為（100.6±2.4）%、（104.7±2.0）%、（100.8±1.1）%；日內(nèi)精密度為0.24%、0.15%、0.70%；日間精密度為1.33%、0.64%、0.28%?；厥章逝c精密度良好。

3.1.3 最低檢測(cè)限與最低定量限以S／N為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度作為分析方法的最低檢測(cè)限，以S／N為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度作為分析方法的最低定量限，測(cè)得HPLC系統(tǒng)條件下的LOD為60 ng／mL，LOQ為160 ng／mL。

3.2 載藥方法考察見表1。結(jié)果表明透析法優(yōu)于其它2種載藥的方法，更適合用于對(duì)CR聚合物膠束載藥。

3.3 透析法工藝優(yōu)化結(jié)果見表1～表4。與實(shí)驗(yàn)選取的其它溶劑相比，乙醇作為PTX溶劑載藥后，粒徑最小，粒徑分布均勻，載藥量和包封率最好。當(dāng)藥物與載體投料比在1∶1.4時(shí)，所得載藥膠束粒徑較小，載藥量最大，包封率最大，SD值較小，故最佳藥載比為1∶1.4。當(dāng)載體濃度在4～7 mg／mL，隨著載體濃度的增加，增大了PTX與聚合物膠束接觸的機(jī)率，使得載藥量增加。載體濃度在7～8 mg／mL時(shí)，增大載體濃度，載藥量和包封率不增反降。因此，確定最佳載體濃度為7 mg／mL。

按最佳載藥工藝重復(fù)3批，驗(yàn)證結(jié)果見表5。

表1 不同載藥工藝對(duì)CR聚合物膠束載藥的影響

表1 不同載藥工藝對(duì)CR聚合物膠束載藥的影響

方法直接溶解法乳化法透析法n 3 3 3粒徑／nm 258.0±2.3—218.2±1.7粒度分布／PI 0.106±0.034—0.107±0.016載藥量／% 17.38±1.09—22.75±2.15包封率／% 38.07±2.72—47.73±4.28

表2 不同PTX溶劑對(duì)CR聚合物膠束載藥的影響

表2 不同PTX溶劑對(duì)CR聚合物膠束載藥的影響

溶劑甲醇乙醇丙酮N，N-二甲基甲酰胺二甲基亞砜n 3 3 3 3 3粒徑／nm 215.2±15.5 205.5±23.4 224.4±9.8 229.7±23.5 220.8±21.4粒度分布／PI 0.105±0.061 0.124±0.042 0.134±0.009 0.058±0.034 0.119±0.042載藥量／% 17.69±2.41 21.34±2.09 20.88±1.30 18.11±8.09 21.56±2.41包封率／% 38.31±7.63 48.37±6.36 47.11±4.38 40.11±22.26 43.57±4.98

表3 不同載藥量與載體投料比對(duì)CR聚合物膠束載藥的影響

表3 不同載藥量與載體投料比對(duì)CR聚合物膠束載藥的影響

PTX與CR聚合物投料比（w／w）1∶1.8 1∶1.6 1∶1.4 1∶1.2 1∶1 n 3 3 3 3 3粒徑／nm 236.4±9.0 201.9±23.9 218.5±5.4 219.2±4.4 237.4±9.4粒度分布／PI 0.090±0.031 0.091±0.025 0.081±0.017 0.042±0.011 0.039±0.009載藥量／% 17.28±2.10 21.42±2.57 26.44±2.30 23.74±4.96 21.27±2.40包封率／% 38.30±5.27 43.89±6.66 51.89±6.13 42.78±5.08 26.94±4.02

表4 不同載體濃度對(duì)CR聚合物膠束載藥的影響

表4 不同載體濃度對(duì)CR聚合物膠束載藥的影響

CR聚合物濃度／（mg／mL）4 5 6 7 8 n 3 3 3 3 3粒徑／nm 223.9±26.7 217.2±36.5 201.2±20.4 191.0±2.8 210.6±10.2粒度分布／PI 0.148±0.068 0.113±0.033 0.119±0.043 0.081±0.088 0.114±0.016載藥量／% 17.40±7.13 19.97±2.87 23.72±2.74 26.13±1.19 17.21±7.86包封率／% 36.87±17.91 43.91±10.64 55.73±6.47 56.92±5.16 37.29±19.92

表5 最佳載藥工藝驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

通過對(duì)載藥方法的研究和透析法單因素考察，綜合考慮藥物的載藥量、包封率、粒徑，其體現(xiàn)出較好的載藥性能，且粒徑較小，粒徑分布均勻，有利于其在體內(nèi)的傳遞及增加PTX的口服生物利用度，減少毒副作用［2－3］。我們確定的最佳載藥工藝為：取CR聚合物，加2.6 mL蒸餾水，室溫下攪拌溶解，冰水浴探頭超聲10 min，滴加30 mg／mL PTX的乙醇溶液430 μL至CR聚合物溶液中，攪拌20 min，冰水浴探頭超聲30 min，蒸餾水透析12 h，冰水浴探頭超聲20 min，3 500 r／min離心10 min，上清液用0.8 μm濾膜過濾，得到的PTX／CR聚合物膠束溶液。

［1］WANG X，CHEN Y，DAHMANI F Z，et al.Amphiphilic carboxymethyl chitosan-quercetin con jugate with P-gp inhibitory properties for oral delivery of paclitaxel［J］.Biomaterials，2014，35（26）：7654-65.

［2］LIU Z，ZHANG F，KOH G Y，et al.Cytotoxic and antiangiogenic paclitaxel solubilized and permeation-enhanced by natural product nanoparticles［J］.Anticancer Drugs，2015，26（2）：167-79.

［3］LV W，CHENG L，LI B.Development and evaluation of a novel TPGS-mediated paclitaxel-loaded PLGA-mPEG nanoparticle for the treatment of ovarian cancer［J］.Chem Pharm Bull（Tokyo），2015，63（2）：68-74.

R284.2

B

1000-338X（2017）01-0016-03

2016-09-21

國家自然科學(xué)基金資助課題（81603301），福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015Y0064），福建中醫(yī)藥大學(xué)重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)（X2014098-學(xué)科）

郭陽麗（1991—），女，2014級(jí)藥劑學(xué)專業(yè)碩士研究生。主要從事藥物制劑技術(shù)的研究。

王曉穎（1978—），女，副教授。E-mail：wangxy623@yeah. net