周建衡，林久茂，鐘曉勇，洪振豐（.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州50；.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州50；.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州50004）

·實(shí)驗(yàn)研究·

前列寧膠囊調(diào)控Caspase-3通路治療良性前列腺增生的機(jī)制

周建衡1，林久茂2，鐘曉勇3，洪振豐2
（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州350004）

目的研究前列寧膠囊治療良性前列腺增生（BPH）的機(jī)制。方法用SD大鼠制作BPH模型，光鏡觀察6組大鼠前列腺組織病理改變，Real-time PCR法檢測6組大鼠前列腺組織Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax及bcl-2基因表達(dá)，BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)，前列寧膠囊不同劑量干預(yù)，比色法分析Caspase-8、Caspase-3活化，Real-time PCR檢測Fas、Bax及bcl-2基因表達(dá)，Westen-blot檢測Fas、bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果病理顯示前列腺病理組織明顯改善，前列腺組織中Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax基因表達(dá)增強(qiáng)，bcl-2表達(dá)降低；BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)，前列寧膠囊干預(yù)后，倒置顯微鏡觀察BPH-1細(xì)胞胞密度明顯減少，細(xì)胞變小，細(xì)胞凋亡增加，前列寧膠囊不同劑量干預(yù)比色法分析Caspase-8、Caspase-3活化增強(qiáng)，Real-time PCR、Westen-blot檢測Fas、Bax基因及蛋白表達(dá)增強(qiáng)，bcl-2降低。結(jié)論前列寧膠囊調(diào)控Caspase-3通路中的相關(guān)因子，促進(jìn)前列腺組織細(xì)胞凋亡，是其治療BPH的機(jī)制。

前列寧膠囊；前列腺良性增生；細(xì)胞凋亡

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)前列寧膠囊治療良性前列腺增生（BPH）有明顯效果，能夠促進(jìn)BPH-1凋亡、抑制細(xì)胞增殖，并調(diào)控多種細(xì)胞因子，但其治療BPH機(jī)制尚未明了［1-4］。本實(shí)驗(yàn)通過研究前列寧膠囊對(duì)caspase-3信號(hào)通路過程中的相關(guān)因子Fas、caspase-8的影響，探討前列寧膠囊治療BPH的機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株健康SPF級(jí)成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量190～220 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬2007-0005），批號(hào)：0017446。正常喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。BPH-1細(xì)胞株（南開大學(xué)生命科學(xué)院分子生物研究所）。

1.2 藥物制備前列寧膠囊（福建省人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號(hào)：閩Z20110009）。動(dòng)物治療濃度：前列寧膠囊低中高劑量組［2.25 g／（kg／d）組、4.5 g／（kg／d）組、9 g／（kg／d）組］。細(xì)胞干預(yù)濃度：用40%DMSO溶解，配制成0.5 g／mL溶液，經(jīng)高壓滅菌后，4℃保存待用。用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成10 mg／mL過濾后再配成0、1.25、2.5、5 mg／mL的終濃度。

1.3 試劑丙酸睪酮注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：25 mg／mL，批號(hào)：H31020524）；保列治（杭州默沙東制藥公司，批號(hào)：J20050041）；RT試劑盒、Trizol、PCR試劑盒（大連Takara Biotechnolo gy公司）；Taq聚合酶、Rnaseinhibitor（日本TaK-aRa公司）；引物由上海英俊生物有限公司合成；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶，胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司）；Caspase-3、Caspase-8檢測試劑盒（美國Biovision公司）；Caspase-3、Caspase-8底物Asp-Glu-Val-Asp（DEAD）-p-nitroaniline（pNA），Bcl-2、Bax、Fas一抗、二抗，DAB（河北博海生物工程開發(fā)有限公司）。

1.4 儀器RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DLSB-5／20低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；B-290型實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī)（瑞士Buchi公司）；多功能彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）；ELX800酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；HF212UV CO2培養(yǎng)箱、IX70熒光倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；GST-1型PCR儀（英國Gstorm公司）；Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、APC 300型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；DU-650型蛋白核酸分析儀（美國Beckman公司）；LG16-3高速冷凍離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；流失細(xì)胞儀（美國BD公司）。

2 方法

2.1 BPH大鼠動(dòng)物模型的制備、給藥及取材SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，100 mg／kg氯胺酮腹腔注射麻醉，經(jīng)陰囊行無菌手術(shù)，摘除雙側(cè)睪丸，恢復(fù)1周

后，每只皮下注射5 mg／（kg／d）丙酸睪酮，連續(xù)28 d，每周稱體質(zhì)量1次。造模成功后，6組繼續(xù)注射造模的同時(shí)，空白對(duì)照組和病理模型組大鼠灌服生理鹽水，其余6組按照相應(yīng)劑量給藥。給藥劑量為：空白組、病理模型組生理鹽水10 ml／（kg／d）、保列治組0.5 mg／（kg／d）、前列寧膠囊低劑量組2.25 g／（kg／d）、中劑量組4.5 g／（kg／d）、高劑量組9 g／（kg／d），灌胃給藥每日1次，連續(xù)28 d。給藥期間，每周稱體質(zhì)量／次以調(diào)整給藥劑量。末次灌胃后禁食24 h，各鼠稱質(zhì)量，麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離出完整的前列腺組織，測量前列腺濕重和體積，計(jì)算前列腺指數(shù)。6組取相同部位的前列腺組織1塊，10%福爾馬林固定液固定，待測。6組取50～100 mg前列腺組織保存于液氮中，待測。

2.2 BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察BPH-1細(xì)胞株置含10%熱滅活FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長期的BPH-1細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，BPH-1細(xì)胞按2×105、個(gè)細(xì)胞／孔接種到6孔板中，每組設(shè)0、1.25、2.5、5 mg／mL劑量組，2個(gè)復(fù)孔，每孔用2 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的前列寧膠囊處理，前列寧膠囊干預(yù)BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

2.3 RealtimePCR法檢測大鼠前列腺組織中Caspase-3、Caspase-8、Fas、Bax、Bcl-2及BPH-1中Fas、Bax、Bcl-2基因表達(dá)取新鮮凍存前列腺組織和BPH-1細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop蛋白核酸分析儀檢測RNA純度和濃度。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（反應(yīng)體系20 μL），得到cDNA模板。取cDNA模板1 μL進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)總體積20 μL，反應(yīng)體系包括2×SYBR GreenMaster Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DEPC水7 μL，混勻。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性2 min（95℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸60 s，循環(huán)40次），引物見表1和表2。上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增，在每次循環(huán)延伸處收集熒光信號(hào)，分析整理數(shù)據(jù)。

表1 BPH-1細(xì)胞Fas、Bax、Bcl-2和GAPDH基因的引物序列

表2 大鼠Fas、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、GAPDH基因的引物序列

2.4 比色法分析BPH-1細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-3的活化BPH-1細(xì)胞按2×105個(gè)細(xì)胞／孔接種到6孔板中，每孔用2 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，前列寧前囊高中低濃度處理24 h后的細(xì)胞，用裂解液在冰上放置30 min，裂解的細(xì)胞16 000 r／min離心10 min，100 μg的蛋白質(zhì)加50 μL的Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）-p-nitroaniline-pNA（caspase-3特異底物）或Leu-Glu-His-Asp-pNA（caspase-8特異底物），37℃避光反應(yīng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測樣品在405 nm處的吸光度值。

2.5 檢測BPH-1細(xì)胞中Fas、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)Western Blot法檢測Bax的蛋白表達(dá)。BPH-1細(xì)胞按2×105個(gè)細(xì)胞／孔接種到6孔板中，每孔用2 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，前列寧前囊高中低濃度處理24 h后的細(xì)胞，用裂解液抽提。含有等量蛋白的細(xì)胞裂解液用樣品緩沖液溶解后，將細(xì)胞的蛋白樣品定量，變性，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。脫脂牛奶封閉2 h；洗膜，加入Fas、Bax、Bcl-2（稀釋倍數(shù)1∶1 000）的一抗以及β-actin（稀釋倍數(shù)1∶1 000）作為陽性對(duì)照，4℃震蕩過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋倍數(shù)1∶25 000）后，室溫孵育1 h，用含0.25%tween-20的TBS洗膜，加1∶1的ECL發(fā)光液，25℃溫育5 min，立即曝光，等條帶清晰后將膠片取出，用凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 前列寧膠囊對(duì)大鼠前列腺組織病理形態(tài)的影響正常組大鼠前列腺組織細(xì)胞腺上皮呈單層柱狀，核橢圓形，腺體無擴(kuò)張，間質(zhì)無增生；模型組腺上皮呈假復(fù)層，細(xì)胞排列緊密，腺腔上皮增生呈多層，QC及保列治治療組較模型組病變明顯減輕，腺上皮呈單層柱狀，核位于基底部，腺體數(shù)目明顯減少，見圖1。

圖1 SD大鼠前列腺組織病理改變圖（×100）

3.2 前列寧膠囊對(duì)SD大鼠前列腺組織中Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)見表3。

表3 SD大鼠前列腺組織Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)

表3 SD大鼠前列腺組織Fas、Caspase-8、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別空白組模型組保列治組低劑量組中量組組高劑量組Bcl-2 1.0±0.1 3.1±0.51）1.6±0.32）2.4±0.22）1.6±0.42）1.3±0.42）Fas 4.0±1.1 2.0±0.41）3.7±0.82）2.9±0.22）3.6±0.42）3.7±0.42）Caspase-8 4.2±0.4 2.9±0.21）3.3±0.42）3.5±0.42）4.6±0.82）3.5±0.52）Caspase-3 4.8±0.8 2.3±0.51）2.6±0.32）2.5±0.8 4.5±0.62）4.0±0.22）Bax 1.0±0.2 0.5±0.11）0.8±0.22）0.6±0.1 0.9±0.22）1.1±0.22）

圖2 高中低劑量前列寧膠囊干預(yù)BPH-1細(xì)胞倒置顯微鏡鏡下改變圖（×100）

3.3 前列寧膠囊對(duì)BPH-1細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活力的影響見圖2。圖2所示，通過倒置顯微鏡可觀察到細(xì)胞形態(tài)逐漸改變，細(xì)胞數(shù)逐漸減少，細(xì)胞多呈圓形，體積縮小，細(xì)胞懸浮，脫落而死亡，細(xì)胞完整性和數(shù)量下降。

3.4 前列寧膠囊對(duì)BPH-1細(xì)胞中Caspase-8、caspase-3活化影響見表4。

表4 QC干預(yù)BPH-1對(duì)Caspase-8和Caspase-3活化的影響

表4 QC干預(yù)BPH-1對(duì)Caspase-8和Caspase-3活化的影響

注：與0 mg／mL組比較，1）P＜0.05。

組別0 mg／mL組1.25 mg／mL組2.5 mg／mL組5 mg／mL組Caspase-3 1.0±0.1 1.3±0.11）1.8±0.11）3.0±0.21）Caspase-8 1.0±0.2 1.1±0.3 1.4±0.21）1.6±0.41）

前列寧膠囊作用24 h后，BPH-1細(xì)胞中Caspase-8、caspase-3的活化，隨著藥物濃度的升高。

3.5 前列寧膠囊對(duì)BPH-1細(xì)胞Fas、Bax、Bcl-2基因及蛋白的影響見表5、圖3。

表5 高中低劑量前列寧膠囊干預(yù)BPH-1對(duì)Fas、Bax、Bcl-2基因的影響

表5 高中低劑量前列寧膠囊干預(yù)BPH-1對(duì)Fas、Bax、Bcl-2基因的影響

注：與0 mg／mL組比較，1）P＜0.05。

組別0 mg／mL組1.25 mg／mL組2.5 mg／mL組5 mg／mL組Bcl-2 1.0±0.41 0.6±0.071）0.3±0.121）1.5±0.341）Bax 1.0±0.04 1.5±0.221）1.6±0.121）1.8±0.231）Fas 1.0±0.62 1.0±0.231）1.5±0.341）1.7±0.571）

圖3 高中低劑量前列寧膠囊干預(yù)BPH-1對(duì)Fas、Bax、Bcl-2蛋白影響的電泳圖

4 討論

4.1 細(xì)胞凋亡是遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程，這個(gè)過程中在一系列酶參與基因控制下，細(xì)胞有程序死亡。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，Caspase凋亡信號(hào)通路可通過外源性和內(nèi)源性凋亡通路在TNF、Fas的啟動(dòng)劑誘導(dǎo)下，最終導(dǎo)致caspase-8活化，進(jìn)一步使caspase-3活化，并引起隨后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［5-10］。

4.2 在本實(shí)驗(yàn)中，用大鼠模型及BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)，前列寧膠囊干預(yù)治療，大鼠實(shí)驗(yàn)表明，正常組大鼠前列腺組織細(xì)胞腺上皮呈單層柱狀，核橢圓形，位于基底部，腔內(nèi)無或少許分泌物，腺體無擴(kuò)張，間質(zhì)無增生；模型組腺上皮呈假復(fù)層，細(xì)胞排列緊密，核位于基底部，腺腔上皮增生呈多層表明造模成功。前列寧膠囊及保列治治療組較模型組病變明顯減輕，腺上皮呈單層柱狀，核位于基底部，腺體數(shù)目明顯減少，表明前列寧膠囊對(duì)大鼠前列腺增生具有明顯治療作用。Real-time PCR檢測各組大鼠前列腺組織中Fas、caspase-8、caspase-3、Bax、Bcl-2基因顯示，前列寧膠囊治療組中，F(xiàn)as、caspase-8、caspase-3、Bax基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，并成量效關(guān)系，Bcl-2基因表達(dá)隨前列寧膠囊濃度增加明顯減弱，表明前列寧膠囊能促進(jìn)BPH大鼠前列腺凋亡，并對(duì)caspase-3通路中相關(guān)因子有明顯調(diào)控作用。前列寧膠囊干預(yù)BPH-1細(xì)胞培養(yǎng)顯示，前列寧膠囊干預(yù)后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞活力明顯降低，凋亡增多；比色法檢測細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-3活化增加，Realtime PCR及Westen-blot檢測Fas、Bax基因、蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2基因、蛋白表達(dá)減弱，離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證前列寧膠囊治療BPH可能是增強(qiáng)caspase-3活力，促進(jìn)相關(guān)因子表達(dá)。

4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，前列寧膠囊對(duì)BPH具有明顯治療作用，其治療機(jī)制是促進(jìn)前列腺細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。由于細(xì)胞凋亡受多種因子調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)中前列寧膠囊可上調(diào)Fas、caspase-8、caspase-3含量，使Bax基因、蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2基因、蛋白表達(dá)減弱?？傊?，前列寧膠囊調(diào)控caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是其治療BPH的重要機(jī)制之一。

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R285.6

A

1000-338X（2017）01-0009-04

2016-10-26

國家自然科學(xué)基金資助課題（81373817，81273938），福建省自然科學(xué)基金資助課題（2015J01333）

周建衡（1968—），男，副教授，主要從事老年男性疾病的中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

洪振豐（1953—），男，教授。E-mail：zfHong1953@163.com