馬力鵬，黃濤，劉乙，李夢(mèng)尋，李濤，沈永巧，孫敬禮，魯慧文

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19、Neat1、Meg3、Gas5在梅山與杜洛克豬卵泡及各組織中的差異表達(dá)分析

馬力鵬，黃濤*，劉乙，李夢(mèng)尋，李濤，沈永巧，孫敬禮，魯慧文

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

為探討lncRNA在卵泡及組織中的表達(dá)規(guī)律，采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)lncRNA H19、Neat1、Meg3、Gas5基因在杜洛克與梅山豬各級(jí)卵泡和豬不同組織中的表達(dá)量變化。結(jié)果表明:H19基因在杜洛克豬各級(jí)卵泡S、M1、M2、L中的表達(dá)量分別是梅山豬的3.61、0.57、4.19、3.27倍,各級(jí)卵泡品種間差異極顯著（P<0.01）；Neat1基因在杜洛克豬各級(jí)卵泡中的表達(dá)量分別是梅山豬的3.94、1.16、1.63、1.44倍，其中S卵泡品種間差異極顯著（P<0.01）；Meg3基因在杜洛克豬各級(jí)卵泡中的表達(dá)量分別是梅山豬的2.78、1.12、10.65、1.41倍，S、M2卵泡品種間差異極顯著（P<0.01）；Gas5基因在杜洛克豬各級(jí)卵泡中的表達(dá)量分別是梅山豬的4.53、1.40、6.31、1.14倍，S、M2卵泡品種間差異極顯著（P<0.01）,M1卵泡中差異顯著（P<0.05）。組織表達(dá)分析結(jié)果表明，各基因在下丘腦、垂體、子宮、卵巢等組織中均有表達(dá)。此研究表明，4個(gè)lncRNA基因在杜洛克和梅山豬中表達(dá)量存在較大差異，可能影響卵泡的增殖、發(fā)育和成熟。

豬；LncRNA；H19；Neat1；Meg3；Gas5；差異表達(dá)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類(lèi)在基因組轉(zhuǎn)錄中不參與編碼蛋白、長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[1-2]。其在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面調(diào)控基因的表達(dá)中起著重要作用，并參與染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪接等多種生物進(jìn)程。近年來(lái)研究表明，1ncRNA以RNA形式參與了X染色體沉默、染色體修飾和基因組印跡、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程[3-4]。lncRNA參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程，其異常表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響[5-6]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的1ncRNA被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮作用。

lncRNA H19共有5個(gè)外顯子，堿基序列長(zhǎng)度約2.3 kb，為只轉(zhuǎn)錄RNA不翻譯成蛋白質(zhì)的母方表達(dá)、父方緘默的印記基因，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以調(diào)節(jié)性RNA或者核糖體調(diào)節(jié)子的方式發(fā)揮作用[7]。H19在進(jìn)化上高度保守，胚胎發(fā)育期高表達(dá)，胎兒出生后大多數(shù)組織中表達(dá)下調(diào)，H19也與腫瘤密切相關(guān)，不同癌癥中作用并不一致[8-9]。lncRNA Neat1是“paraspeckles”這種核體結(jié)構(gòu)的重要組成元件 (paraspeckles是RNA結(jié)合蛋白的一個(gè)家族),又稱(chēng)為MENε/β或VINC，它從人類(lèi)第1號(hào)染色體上一個(gè)被稱(chēng)為多發(fā)性?xún)?nèi)分泌瘤病(MEN)I型的基因位點(diǎn)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而來(lái)。lncRNA Meg3(maternal expressed gene 3,Meg3)是小鼠母系印記基因Glt2(genetrap locus 2,Glt2)的人類(lèi)同系物，位于人染色體上，由10個(gè)外顯子組成，通過(guò)可變剪切可產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本，在多種正常組織中均有表達(dá)，但在多種腫瘤中表達(dá)水平明顯降低或出現(xiàn)缺失[11]。LncRNA Gas5(growth arrestspecific 5)是近年發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞增殖生長(zhǎng)相關(guān)的新的LncRNA，在淋巴細(xì)胞和外周血T細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著極其重要的作用，Gas5的下調(diào)可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖[12]。

排卵數(shù)是豬窩產(chǎn)仔數(shù)的第一個(gè)決定因素。高排卵數(shù)與低排卵數(shù)品種母豬在卵泡期中后段表現(xiàn)出卵泡發(fā)育動(dòng)力學(xué)差異，前者中等卵泡選擇時(shí)段延長(zhǎng)并產(chǎn)生更多排卵前卵泡。卵泡選擇和成熟的動(dòng)態(tài)變化受高度同步、精確的基因表達(dá)調(diào)控。鑒于lncRNA具有廣泛而重要的表達(dá)調(diào)控功能和對(duì)動(dòng)物生殖的重要作用，本研究擬選取已報(bào)道的其對(duì)人類(lèi)、小鼠等的疾病、生殖、卵泡發(fā)育、免疫調(diào)控等方面有影響但其對(duì)豬繁殖性能的影響尚不清楚的 LncRNA H19、Neat1、Meg3和Gas5基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)在杜洛克與梅山豬不同級(jí)別卵泡和各組織中的表達(dá)規(guī)律并對(duì)其研究分析，以此來(lái)解析各基因?qū)Σ煌i種卵泡的調(diào)控作用和對(duì)其排卵數(shù)的影響，以期為深入研究影響排卵數(shù)的分子機(jī)理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)，為豬的繁殖性能提高提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取同一胎次、發(fā)情正常、繁殖表現(xiàn)符合品種特征的梅山和杜洛克成年母豬各3頭，同一條件下飼喂，每天早晚各觀測(cè)1次發(fā)情表現(xiàn)，以發(fā)情出現(xiàn)靜立反應(yīng)時(shí)記為發(fā)情周期第0天，在發(fā)情周期第14天注射獸用氯前列醇鈉注射液1支(0.2 mg/支)，注射后96 h屠宰取卵泡樣，按直徑（小卵泡S:1-3 mm,中等卵泡 M1:3.0-4.9 mm，中等卵泡 M2:5.0-6.9 mm，大卵泡L:直徑≥7.0 mm）分別裝在凍存管中液氮速凍；同時(shí)取其他組織樣（包括肺臟、心臟、脾臟、子宮、輸卵管、小腸、腎臟、肌肉、脂肪、肝臟、垂體、下丘腦等），液氮速凍。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自Takara公 司 ，TRIzolReagent購(gòu)自Thermo Fisher scientific，LightCycler 480 SYBR Green I Master購(gòu)自Biocompare公司，氯前列醇鈉購(gòu)自寧波三生藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

試驗(yàn)樣品各取100 mg于液氮中研磨，用Trizol法分別提取總RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。RNA反轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄cDNA放在-20℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

從GenBank上搜索和相關(guān)文獻(xiàn)中查找不同物種lncRNA H19、Neat1、Meg3、Gas5的序列或引物，利用DNAMAN對(duì)比選取部分保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，用于Real-time qPCR分析。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因、引物序列、退火溫度和產(chǎn)物大小Tab.1 genes,primer sequences,annealing temperature and the amplified fragment

1.2.3 Real-timeqPCR檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)

杜洛克與梅山豬各級(jí)卵泡總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA稀釋成相同濃度作為模板，以GAPDH基因因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在杜洛克與梅山豬不同級(jí)別卵泡中的表達(dá)水平?？偡磻?yīng)體系為20 μL：SYBR Green I Master 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板cDNA 1 μL,去離子水7 μL。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸120 s，共45個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5 min，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

以 2-△△Ct法[13-15]計(jì)算長(zhǎng)鏈非編碼 RNA在兩品種豬各級(jí)別卵泡中的相對(duì)表達(dá)量，采用SPSS17.0軟件的One-way ANOVA方法分析，比較梅山與杜洛克不同級(jí)別卵泡中長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)水平的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 lncRNA在不同品種豬各級(jí)卵泡間的表達(dá)差異

利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)lncRNA在不同品種豬各級(jí)卵泡間的差異表達(dá)進(jìn)行研究，分析其表達(dá)規(guī)律，結(jié)果見(jiàn)圖1-圖4。

圖1 LncRNA-H19基因在杜洛克、梅山豬各級(jí)卵泡之間的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression amounts of LncRNA-H19 gene in follicles of different sizes

圖2 LncRNA-Neat1基因在杜洛克、梅山豬各級(jí)卵泡之間的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression amounts of LncRNA-Neat1 gene in follicles of different sizes

由圖1可知，lncRNA H19基因在杜洛克豬中的表達(dá)規(guī)律為M2>S≥M1≥L,在梅山豬中的表達(dá)規(guī)律為M1≥M2>S>L(≥代表極顯著高于，>代表顯著高于和不顯著高于)。在杜洛克豬各級(jí)卵泡S、M1、M2、L中的表達(dá)量分別是梅山豬的3.61、0.57、4.19、3.27倍，該基因在杜洛克豬S、M2、L卵泡中的表達(dá)量均極顯著高于梅山豬（P<0.01），但在M1卵泡中的表達(dá)量極顯著低于梅山豬。

由圖2可知，LncRNA Neat1基因在杜洛克豬中的表達(dá)規(guī)律為M1>S≥M2>L,在梅山豬中的表達(dá)規(guī)律為M1≥M2>L>S(≥代表極顯著高于，>代表顯著高于和不顯著高于)。在杜洛克豬各級(jí)卵泡S、M1、M2、L中的表達(dá)量分別是梅山豬的3.94、1.16、1.63、1.44倍，該基因在杜洛克豬S卵泡中的表達(dá)量極顯著高于梅山豬（P<0.01），在M1、M2、L卵泡中的表達(dá)量均高于梅山豬，但均不顯著。

圖3 LncRNA-Meg3基因在杜洛克、梅山豬各級(jí)卵泡之間的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression amounts of LncRNA-Meg3 gene in follicles of different sizes

圖4 LncRNA-Gas5基因在杜洛克、梅山豬各級(jí)卵泡之間的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression amounts of LncRNA-Gas5 gene in follicles of different sizes

由圖3可知，LncRNA Meg3基因在杜洛克豬中的表達(dá)規(guī)律為M2>M1>S≥L，在梅山豬中的表達(dá)規(guī)律為M1≥S>L>M2(≥代表極顯著高于，>代表顯著高于和不顯著高于)。在杜洛克豬各級(jí)卵泡S、M1、M2、L中的表達(dá)量分別是梅山豬的 2.78、1.12、10.65、1.41倍，該基因在杜洛克豬S和M2卵泡中的表達(dá)量均極顯著高于梅山豬（P<0.01），在M1和L卵泡中的表達(dá)量高于梅山豬，但均不顯著。

由圖4可知，LncRNA Gas5基因在杜洛克豬中的表達(dá)規(guī)律為M1≥M2>S≥L,在梅山豬中的表達(dá)規(guī)律為M1≥S>L>M2(≥代表極顯著高于，>代表顯著高于和不顯著高于)。在杜洛克豬各級(jí)卵泡S、M1、M2、L中的表達(dá)量分別是梅山豬的4.53、1.40、6.31、1.14倍，該基因在杜洛克豬S和M2卵泡中的表達(dá)量均極顯著高于梅山豬（P<0.01），在M1卵泡中的表達(dá)量顯著高于梅山豬，在L卵泡中的表達(dá)量不顯著。

圖5 LncRNA-H19基因在豬各組織間的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression amounts of LncRNA-H19 gene in tissues

由圖1-圖4可知，在梅山豬的各級(jí)卵泡中，LncRNA H19、Neat1、Meg3和Gas5基因呈現(xiàn)出規(guī)律性表達(dá)，且均在M1卵泡中高表達(dá)，表達(dá)量分別為9.78、4.11、8.86、7.96，在其他卵泡中相對(duì)表達(dá)量較低，且同一基因在M1卵泡中的表達(dá)量極顯著高于S、M2和L卵泡。但在杜洛克母豬各級(jí)卵泡中，這些基因在S、M1、M2卵泡中的表達(dá)量相對(duì)較高，同一基因在S、M1、M2卵泡顯著高于L卵泡，整體并沒(méi)有一定的表達(dá)規(guī)律。

2.2 LncRNA在杜洛克豬各組織間的相對(duì)表達(dá)量

利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)不同LncRNA基因在杜洛克豬的心臟、腎臟、肌肉、小腸、脾臟、肝臟、脂肪、肺臟、下丘腦、子宮、卵巢等各組織間的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行研究，對(duì)其表達(dá)規(guī)律做簡(jiǎn)單分析，結(jié)果見(jiàn)圖5-圖8。

圖6 LncRNA-Neat1基因在豬各組織間的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression amounts of LncRNA-Neat1 gene in tissues

由圖5可知，LncRNA H19基因在豬的各組織中均有表達(dá)，其下丘腦中表達(dá)量最高為28.57；在心臟、腎臟、肺臟、脾臟、脂肪和卵巢中高表達(dá)；在肝臟、子宮角、垂體表達(dá)量相對(duì)較低；但在小腸中表達(dá)量最低為1.0。由圖6可知，LncRNA Neat1基因各組織中均有表達(dá)，其在小腸中表達(dá)量最高為6.75，垂體中表達(dá)量最低為0.19；在肌肉、肝臟和脂肪中高表達(dá)，在心臟、腎臟、脾臟、下丘腦、垂體、子宮和輸卵管中低表達(dá)。

圖7 LncRNA-Meg3基因在豬各組織間的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression amounts of LncRNA-Meg3 gene in tissues

圖8 LncRNA-Gas5基因在豬各組織間的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression amounts of LncRNA-Gas5 gene in tissues

由圖7可知，LncRNA Meg3基因各組織中均有表達(dá)，其在小腸中表達(dá)量最高為3.08，在肺臟中表達(dá)量最低為1.0；其他各組織心臟、垂體、子宮、輸卵管等表達(dá)量差異小。由圖8可知，LncRNA Gas5基因在心臟中表達(dá)量最高為9.83，子宮角表達(dá)量最低為0.88，在其他組織腎臟、小腸、卵巢等組織中均有表達(dá)，且表達(dá)差異性小。

由圖5-圖8可知，lncRNA H19、Neat1、Meg3和Gas5基因在豬各組織中均有表達(dá)，但不同基因在各組織中表達(dá)差異很大，lncRNA H19、Meg3和Gas5在下丘腦、子宮、卵巢等與繁殖有關(guān)的組織中的表達(dá)量相對(duì)較高且趨于穩(wěn)定，lncRNA H19、Neat1、Meg3和Gas5在豬不同組織中表達(dá)量的不同，說(shuō)明lncRNA的表達(dá)具有時(shí)空特異性。

3 討論

（1）H19是不編碼蛋白的印記基因，Obata等[16]檢測(cè)了重構(gòu)孤雌胚和受精胚發(fā)育的胎兒中印跡基因的表達(dá)，提出卵母細(xì)胞直徑影響每一個(gè)印跡基因的表觀遺傳修飾的調(diào)控。卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中不斷發(fā)生印跡基因的重建擦除，染色質(zhì)的重新構(gòu)建，這一過(guò)程為卵泡的發(fā)育成熟，成功受精起到關(guān)鍵作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)H19在梅山豬M1卵泡中高表達(dá)，不同豬種M1卵泡中該基因表觀遺傳修飾的水平有差異，可能在梅山豬M1卵泡中對(duì)該基因的重建擦除過(guò)程較為活躍，促進(jìn)染色質(zhì)的重新構(gòu)建，為卵泡后期的持續(xù)發(fā)育和進(jìn)一步選擇形成更多的成熟卵泡排出體外創(chuàng)造有利條件。組織表達(dá)量發(fā)現(xiàn)該基因在心臟、腎臟、下丘腦和卵巢中有較高表達(dá)，說(shuō)明該基因表達(dá)對(duì)繁殖性能具有重要的作用。

（2）Neat1參與形成旁斑(paraspeckle)結(jié)構(gòu),參與調(diào)控細(xì)胞的分化和生長(zhǎng),王靜等[18]通過(guò)對(duì)雌性小鼠注射hCG，發(fā)現(xiàn)1ncRNA Neat最先表達(dá)于有腔卵泡的顆粒細(xì)胞，隨著黃體的形成和黃體細(xì)胞的分化，其表達(dá)逐漸增加，48 h后在黃體細(xì)胞中表達(dá)達(dá)到高峰，推測(cè)Neat1促進(jìn)黃體的形成，對(duì)卵泡發(fā)育和選擇有抑制作用；敲除Neat1小鼠黃體分泌孕激素減弱，降低了雌性小鼠的生殖功能。本研究中Neat1在梅山豬各級(jí)卵泡中低表達(dá)，可能使得對(duì)梅山豬卵泡發(fā)育和選擇的抑制作用減弱，因而可選擇和募集更多的卵泡，從而提供較高的排卵數(shù)。而在杜洛克中高表達(dá)，可能與杜洛克卵泡發(fā)育停滯閉鎖有關(guān)。組織表達(dá)量發(fā)現(xiàn)該基因在于繁殖有關(guān)的組織中低表達(dá)，可能對(duì)有繁殖有關(guān)過(guò)程的促進(jìn)作用減弱，從而影響到母豬的繁殖性能。

（3）Meg3基因母源性的印記基因，對(duì)細(xì)胞的發(fā)育、成熟、增殖、凋亡具有調(diào)控作用，胡艷妹等[19]研究發(fā)現(xiàn)Meg3對(duì)胰島β細(xì)胞的增殖、凋亡及胰島素的分泌和合成有調(diào)控作用；大量研究報(bào)道，該基因?qū)Σ煌┘?xì)胞組織中的表達(dá)不同，但目前該基因?qū)β雅莸陌l(fā)育、選擇等方面未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因在高產(chǎn)梅山豬各級(jí)卵泡中均相對(duì)低表達(dá)而在杜洛克豬卵泡中均為高表達(dá)，推測(cè)Meg3可能對(duì)卵泡期卵泡的持續(xù)發(fā)育具有抑制作用，在梅山豬中低表達(dá)對(duì)卵泡持續(xù)發(fā)育抑制作用減弱，促進(jìn)了卵泡期中等卵泡選擇時(shí)段延長(zhǎng)，對(duì)卵泡的進(jìn)一步選擇和發(fā)育成熟有促進(jìn)作用，抑制了導(dǎo)致卵泡持續(xù)發(fā)育和選擇的這一過(guò)程。杜洛克中高表達(dá)其作用可能剛好相反。組織表達(dá)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在各組織中的表達(dá)量都比較低，但均有表達(dá)，說(shuō)明該基因廣泛參與各組織的生物學(xué)過(guò)程。

（4）Gas5基因是Schneider等從cDNA消減文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡中具有非常重要的作用[21]。研究表明，Gas5可能對(duì)mTOR信號(hào)途徑有潛在的負(fù)性調(diào)控作用，表達(dá)上調(diào)時(shí)抑制mTOR信號(hào)途徑的活性，mTOR信號(hào)通路上下游的相關(guān)基因和蛋白具有不同的作用,各種因素激活相關(guān)通路后，對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育起到反饋或級(jí)聯(lián)放大的作用，最終均可能引起卵泡的過(guò)度增殖或抑制[22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因在高產(chǎn)梅山豬各級(jí)卵泡中均相對(duì)低表達(dá)，其中在M1、M2卵泡中顯著和極顯著低表達(dá)，這很可能與高產(chǎn)豬中等卵泡在卵泡期第4天擁有繼續(xù)發(fā)育的能力相關(guān)，而在同一時(shí)期杜洛克等低產(chǎn)豬的中等卵泡已經(jīng)喪失了繼續(xù)發(fā)育的能力，說(shuō)明Gas5基因的低表達(dá)對(duì)高產(chǎn)母豬中等卵泡的持續(xù)發(fā)育和進(jìn)一步選擇，提高排卵數(shù)有一定的促進(jìn)作用。組織表達(dá)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在下丘腦、卵巢和子宮中表達(dá)量較低，說(shuō)明該基因?qū)ωi繁殖性能的提高有影響。

綜上所述，這些lncRNA在不同豬種各級(jí)卵泡中的表達(dá)量不同，且具有一定的表達(dá)規(guī)律，高產(chǎn)母豬卵泡期卵泡的持續(xù)發(fā)育和進(jìn)一步選擇更多的卵泡，排出更多的卵子，從而提高母豬的產(chǎn)仔數(shù)有促進(jìn)作用；低產(chǎn)母豬在卵泡期第4天這些lncRNA對(duì)卵泡的發(fā)育間接和直接作用使得卵泡閉鎖停滯，使其排出的卵泡數(shù)有限影響到母豬產(chǎn)仔數(shù)。不同組織表達(dá)量均有不同，這說(shuō)明lncRNA的表達(dá)具有時(shí)空特異性，進(jìn)一步說(shuō)明其在卵泡發(fā)育過(guò)程中具有調(diào)控功能。

[1]楊峰，易凡，曹慧青，等.長(zhǎng)鏈非編碼RNA研究進(jìn)展[J].遺傳，2014，36(5):456-468. Yang F，Yi F，Cao H Q，et al.The emerging landscape of long non-coding RNAs[J].Hereditas，2014，36(5):456-468.

[2]Marques A C，Ponting C P，Catalogues of mammalian long noncoding RNAs:modest conservation and incompleteness [J].Genome Biol，2009，10(11):124.

[3]Johnsson P，Lipovich L，Grander D，et al.Evolutionary conservation of long noncoding RNAs，sequence，structure，function[J].Biochim Biophys Acta，2014，1840(3):1063-1071.

[4]Wilusz J E，Sunwoo H，Spector D L，et al.Long noncoding RNAs:functional surorises from the RNA world[J].Genes Dev，2009，23(13):1494-1504.

[5]Khaitan D，Dinger M E，Mazar J et al.The melanomaupregu-lated long non-coding RNA SPRY4-IT1 modulates apoptosis and invasion[J].Cancer Res，2011，71(11):3852-3862.

[6]Gibb E A，Brown C J，Lam W L.The functional role of long noncoding RNA in human carcinomas[J].Molecular Cancer，2011，10(1):38-44.

[7]魏晨晨，王朝霞.長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19在腫瘤研究中的進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2015，20(11):1041-1044. Wei C C，Wang Z X.Progression of long non-coding RNA H19 in tumors[J].Chinese Clinical Oncology，2015，20(11): 1041-1044.

[8]Lottin S，Adriaenssens E，Dupressoir T，et al.Overexpression of an ectopic H19 gene enhances the tumorigenic properties of breast cancer cells[J].Carcino Genesis，2002，23(11): 1885-1895.

[9]熊偉民，李明峰，宋佳鴻，等.長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13(10): 1945-1948. Xiong W M，Li M F，Song J H，et al.LncRNA H19 promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation and invasion[J].Progress in Modern Biomedicine，2013，13(10):1945-1948.

[10]胡源，曾文先.長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1對(duì)小鼠精子發(fā)生的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，35(12):11-15，38. Huang Y，Zeng W X.Effect of long noncoding RNA NEAT1 on spermatogenesis in mice[J].Acta Ecologiae Animalis Domastici，2014，35(12):11-15，38.

[11]曹娟，文飛球，徐金永，等.長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3在胚胎性橫紋肌肉瘤凋亡中的研究 [J].中國(guó)小兒血液與腫瘤雜志，2013，18(3):120-123，128. Cao J，Wen F Q，Xu J Y，et al.Apoptotic study of long non-oding RNA MEG3 in embryonal rhabdomyosarcoma [J].J China Pediatr Blood Cancer，2013，18(3):120-123，128.

[12]孫豫蘭，路叢，何廣勝，等.兒童重型再生障礙性貧血T細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子GAS5和mTOR信號(hào)途徑分子的表達(dá)研究[J].中國(guó)小兒血液與腫瘤雜志，2014，19(6):311-315. Sun Y L，Lu C，He G S，et al.The abnormal expression of regulatory factors GAS5 and mTOR signaling pathway molecules in T cells in childhood severe aplastic anemia[J].J China Pediatr Blood Cancer，2014，19(6):311-315.

[13]劉麗娟，楊飛，魯慧文，等.miR-26b和miR-224在梅山與杜洛克豬卵泡中的差異表達(dá)分析[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，30(2):164-168. Liu L J，Yang F，Lu H W，et al.Differential expression analysis of miR-26b and miR-224 in ovarian follicles of meishan and Duroc sows[J].Journal of Shihezi University（Natural Science），2012，30(2):164-168.

[14]趙志超，孫敬禮，黃濤，等.杜洛克與梅山豬卵泡中Grb14、eIF4E和SNRPE基因的差異表達(dá)研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，30(6):704-708. Zhao Z C，Sun J L，Huang T，et al.Research into differentially expressed genes Grb14，eIF4E and SNRPE in the follicles between Duroc and Meishan sows[J].Journal of Shihezi University（Natural Science），2012，30(6):704-708.

[15]趙志超，孫敬禮，黃濤，等.梅山與杜洛克母豬發(fā)情前期卵巢組織差異表達(dá)基因的分離與鑒定 [J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，30(2):167-170. Isolation and identification of differential expression genes in ovarian tissues of Meishan and Duroc sows at proestrus stage[J].Journal of Shihezi University（Natural Science），2012，30(2):167-170.

[16]Obata Y，Kono T.Maternal primary imprinting is established at a specific time for each gene throughout oocytc growth [J].J Biol Chem，2002，277(7):5285-5289.

[17]嚴(yán)永旭，胡衛(wèi)華.H19基因在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展[J].國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2014，33(1):44-47. Yan Y X，Hui W H.H19 gene and its significance in assisted reproductive technology [J].Journal of Infernational Rerroductive，2014，33(1):44-47.

[18]王靜，包日強(qiáng)，董麒銘，等.非編碼RNA在卵泡發(fā)育和卵巢疾病中的研究進(jìn)展[J].生殖與避孕，2016，36(2):135-141. Wang J，Bao R Q，Dong Q M，et al.Research progress of non-coding RNA in follicle development and ovarian diseases[J].Reproduction&Contraception，2016，36(2):135-141.

[19]胡艷妹，尤梁惠，朱亞男等.沉默長(zhǎng)鏈非編碼RNA Meg3損傷小鼠胰島細(xì)胞的胰島素分泌功能[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2016，32(3):289-294. Hu Y M，You L H，Zhu Y N，et al.Silencing long nonoding RNA Meg3 impairs the ability of insulin secretion in mice[J]，Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2016，32(3):289-294.

[20]Wang M，Huang T，Luo G，et al.Long non-coding RNA MEG3 induces renal cell carcinoma cells apoptosis by activating the mitochondrial pathway[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2015，35(4):541-545.

[21]Schneider C，King R M，Philipson L.Genes specifically expressed at growth arrest of mammalian cells[J].Cell，1988，54(6):787-793.

[22]曹婉寧，董曉英.mTOR通路參與卵泡生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2016，25(5):469-472. Cao W N，Dong X Y.Research progress of mechanism of mTOR pathway involves follicular development[J].Journal of Reproductive Medicine，2016，25(5):469-472.

Differential expression analysis of lncRNA H19,Neat1,Meg3,Gas5 in follicles and tissues of Duroc and Meishan sows

Ma Lipeng,Huang Tao*,Liu Yi,Li Mengxun,Li Tao,Shen Yongqiao,Sun Jingli,Lu Huiwen
(College of Animal Science and Technolongy,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

In order to investigate the expression pattern of lncRNA in the follicles and tissues,fluorescence quantitative RT-PCR was conducted to detect the expression of lncRNA H19,Neat1,Meg3 and Gas5 in Duroc and Meishan sows'follicles and different tissues of pigs.The results showed that the expression of H19 in follicle S,M1,M2 and L of Duroc was respectively 3.61,0.57,4.19,3.27 times than those in Meishans,and the differences among various follicles with the same size were extremely significant(P<0.01);the expression of Neat1 in follicle S,M1,M2 and L of Duroc was respectively 3.94,1.16, 1.63,1.44 times than those in Meishan,and the differences between various S follicles were obviously significant(P<0.01);the expression of Meg3 in follicle S,M1,M2 and L of Duroc was respectively 2.78,1.12,10.65,1.41 times than those in Meishan,and the differences between follicle S and follicle M2 were extremely significant (P<0.01);the expression of Gas5 in follicle S,M1,M2 and L of Duroc was respectively 4.53,1.40,6.31,1.14 times than those in Meishan,and the differences between follicle S and follicle M2 were extremely significant(P<0.01).The analysis of tissues expression showed that each gene was expressed in the hypothalamus,pituitary,uterus,ovaries and other tissues.The study showed that there was a big difference between the four lncRNAs in the Duroc and Meishan pigs,and they might affect the proliferation,development and maturation of follicles.

sow;LncRNA;H19;Neat1;Meg3;Gas5;differential expression

S828.2

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.01.015

1007-7383(2017)01-0089-06

2016-09-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460586)

馬力鵬（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，e-mail:1355474932@qq.com。

*通信作者：黃濤（1978-），男，副教授，從事豬分子育種研究，e-mail:taohuang100@sina.com。